巴貝斯蟲（Bab）核酸檢測試劑盒說明書

通用名稱：巴貝斯蟲（Bab）核酸檢測試劑盒（熒光 PCR 法）

Name：Babesia Canis Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】50T/盒

【預期用途】

巴貝斯蟲病是一種蜱傳性的血液原蟲病，該病由寄生于紅細胞內(nèi)的多種巴貝斯蟲引起，其臨床特征為發(fā)熱、精神沉郁、嗜睡、黃疸、貧血、血紅蛋白尿、嘔吐、呼吸困難等，對犬的健康造成了巨大的危害。[1-2]

本試劑盒適用于檢測血液中的巴貝斯蟲，用于巴貝斯蟲感染的輔助診斷。

【檢驗原理】

本試劑盒采用 TaqMan 探針法實時熒光 PCR 技術，設計一對巴貝斯蟲基因組特異性引物，結合一條特異性探針，用熒光 PCR 技術對巴貝斯蟲基因組的 DNA 進行體外擴增檢測，用于臨床上對可疑感染者的病原學診斷。

【試劑組成】

說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融次數(shù)不超過 5 次，有效期 12 個月。

【適用儀器】

ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。

【標本采集】

無菌注射器抽取血液 3~5mL 至 EDTA-2Na 抗凝管

【保存和運輸】

上述標本短期內(nèi)可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過 6 個月，標本運送應采用 2~8℃冰袋運輸， 嚴禁反復凍融。

【使用方法】

1. 樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1 樣本前處理

組織樣品：每份組織分別從 3 個不同的位置稱取樣品約 1g，手術剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入

1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉至 1.5mL 滅菌離心管中，8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中；咽拭子樣品直接取 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中。

1.2 核酸提取

推薦采用優(yōu)利科（上海）生命科學有限公司生產(chǎn)的核酸提取或純化試劑（磁珠法或離心柱法）進行核酸提取，請按    照試劑說明書進行操作。

2. 試劑配制（試劑準備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設所需要的 PCR 反應管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照；樣品每滿

10 份，多配制 1 份)，每測試反應體系配制如下表：

將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中，21uL/管。

3. 加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的核酸、陽性質控品、陰性質控品各取 4μL，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻， 短暫離心。

4. PCR 擴增（核酸擴增區(qū)）

4.1 將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內(nèi)；

4.2 設置好通道、樣品信息，反應體系設置為 25μL；

熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列儀器請勿選擇

ROX 參比熒光，選擇 None 即可。

4.3 推薦循環(huán)參數(shù)設置：

5. 結果分析判定

5.1 結果分析條件設定

設置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機器自動分析的結果分析，當曲線出現(xiàn)整體傾斜時，根據(jù)分析后圖像調節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調節(jié))，以及 Threshold 的

Value 值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結果。

5.2 結果判斷

陽性：檢測通道 Ct 值≤35，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線；

可疑：檢測通道 35<Ct 值≤38，建議重復檢測，如果檢測通道仍為 35<Ct 值≤38，且曲線有明顯的增長曲線， 判定為陽性，否則為陰性；

陰性：樣本檢測結果 Ct 值>38 或無 Ct 值。

6. 質控標準

陰性質控品：Ct>38 或無 Ct 值顯示；

陽性質控品：擴增曲線有明顯指數(shù)生長期，且 Ct 值≤32； 以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。

7. 檢測方法的局限性

1. 樣本檢測結果與樣本收集、處理、運送以及保存質量有關；

2. 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結果；

3. 陽性對照、擴增產(chǎn)物泄漏，會導致假陽性結果；

4. 病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結果；

5. 不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結果；

6. 試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準確的結果；

7. 本檢測結果僅供參考，如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段。

【注意事項】

1. 所有操作嚴格按照說明書進行；

2. 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應自然融化，*混勻并短暫離心；

3. 反應液應避光保存；

4. 反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

5. 使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服；

6. 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行，以免交叉污染；

7. 實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

8. 試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通則》進行處理。

【參考文獻】

[1] 李蓓蓓.犬巴貝斯蟲病的診斷與預防[J].今日畜牧獸醫(yī),2019,35(03):99.

[2] 陜西省部分寵物醫(yī)院犬巴貝斯蟲病流行情況及病原鑒定[D]. 唐歡.西北農(nóng)林科技大學，2019.

蜱傳性的血液原蟲病，該病由寄生于紅細胞內(nèi)的多種巴貝斯蟲引起，其臨床特征為發(fā)熱、    精神沉郁、嗜睡、黃疸、貧血、血紅蛋白尿、嘔吐、呼吸困難等，對犬的健康造成了巨大的危害。[1-2]