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輔酶ⅠNAD(H)含量試劑盒說明書

發(fā)布時(shí)間:2023/3/14      點(diǎn)擊次數(shù):495

輔酶ⅠNAD(H)含量試劑盒說明書

                                        微量法100/48

   正式測定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義

輔酶ⅠNAD(H)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,NAD+是糖酵解(EMP)和三羧酸循環(huán)(TCA)的主要?dú)涫荏w,生成的NADH經(jīng)呼吸電子鏈(ETC)傳遞把電子交給氧,在合成ATP的同時(shí),形成大量的ROS,同時(shí)NADH再生為NAD+。糖、脂、蛋白質(zhì)三大代謝物質(zhì)分解中的氧化反應(yīng)絕大部分通過這一體系完成。NAD(H)含量和NADH/NAD+比值的高低可用于評價(jià)糖酵解和TCA循環(huán)的強(qiáng)弱。較高的NAD(H)NADH/NAD+比值說明細(xì)胞呼吸耗氧量較高,處于過氧化狀態(tài)。此外,NADH/NAD+比值升高也可抑制糖酵解和TCA循環(huán)。另外,NAD+降解產(chǎn)物對細(xì)胞信號傳導(dǎo)、代謝和基因表達(dá)等具有重要的調(diào)控作用。

 

測定原理

分別用酸性和堿性提取液提取樣品中NAD+NADH,NADH通過PMS的遞氫作用,還原氧化型噻唑藍(lán)(MTT)為甲瓚,在570nm下檢測吸光值;而NAD+可被乙醇脫氫酶還原為NADH,進(jìn)一步采用MTT還原法檢測。

 

需自備的儀器和用品

酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、移液器、96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

 

試劑的組成和配制

酸性提取液:液體50mL×1瓶,4保存;

堿性提取液:液體50mL×1瓶,4保存;

試劑一:液體10 mL×1瓶,4保存;

試劑二:液體3 mL×1瓶,4保存;

試劑三:粉劑×1瓶,-20 保存,用時(shí)加入3mL蒸餾水,混勻,用不完的試劑4保存一周;

試劑四:粉劑×1瓶,4 保存,用時(shí)加入3mL蒸餾水,混勻,用不完的試劑4保存一周;

試劑五:液體3.6mL×1瓶,4 保存;

試劑六:液體30mL×1瓶,4 保存;

試劑七:液體50mL×1瓶,4 保存。

 

NAD+NADH的提取

1 血清(漿)中NAD+NADH的提取

NAD+的提取:按照血清(漿)體積(mL):酸性提取液體積(mL)為15~10的比例(建議取約0.1mL血清(漿),加入1mL酸性提取液),95℃水浴5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 離心10min;取500μL上清液,加入500μL堿性提取液使之中和,混勻,10000g 4 離心10min,取上清,置冰上待測。

NADH的提取:按照血清(漿)體積(mL):堿性提取液體積(mL)為15~10的比例(建議取約0.1mL血清(漿),加入1mL堿性提取液),95℃水浴5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 離心10min;取500μL上清液,加入500μL酸性提取液使之中和,混勻,10000g 4 離心10min,取上清,

 

冰上待測。

2組織中NAD+NADH的提取

NAD+的提取:按照組織質(zhì)量(g):酸性提取液體積(mL)為15~10的比例(建議取約0.1g組織,加入1mL酸性提取液),冰浴研磨,95℃水浴5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 離心10min;取500μL上清液,加入500μL堿性提取液使之中和,混勻,10000g 4 離心10min,取上清,置冰上待測。

NADH的提取:按照組織質(zhì)量(g):堿性提取液體積(mL)為15~10的比例(建議取約0.1g組織,加入1mL堿性提取液),冰浴研磨,95℃水浴5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 離心10min;取500μL上清液,加入500μL酸性提取液使之中和,混勻,10000g 4 離心10min,取上清,置冰上待測。

3 細(xì)胞或細(xì)菌中NAD+NADH的提取

NAD+的提取:先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi),棄上清,按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):酸性提取液體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL酸性提取液),超聲波破碎(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次),95℃水浴5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 離心10min;取500μL上清液,加入500μL堿性提取液使之中和,混勻,10000g 4 離心10min,取上清,置冰上待測。

NADH的提取:先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi),棄上清,按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):堿性提取液體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL堿性提取液),超聲波破碎(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次),95℃水浴5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 離心10min;取500μL上清液,加入500μL酸性提取液使之中和,混勻,10000g 4 離心10min,取上清,置冰上待測。

 

測定步驟:

1、   分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至570nm,蒸餾水調(diào)零。

2、   加樣表(1.5mL棕色EP管中按下表依次加樣):

試劑名稱(μL)

對照管

測定管

樣本

20

20

試劑一

80

80

試劑二

30

30

試劑三

30

30

試劑四

30

30

試劑五

30

30

試劑六

200

混勻,室溫避光靜置20min

試劑六


200

充分混勻,靜置5min后,20000g,25離心5min,棄上清,沉淀中加入:

試劑七

400

400

混勻,取200μL轉(zhuǎn)移至微量石英比色皿或96孔板中,570nm下讀取對照吸光值A1和測定管吸光值A2,計(jì)算A=A2-A1。

 

注意事項(xiàng)

1、如果一次性測定樣本數(shù)較多,可將試劑一、二、三和四按比例配成混合液。

2、對照管和測定管的測定步驟的區(qū)別:對照管加完試劑一、二、三、四和五后必須馬上加試劑六;測定管

 

加完試劑一、二、三、四和五后必須反應(yīng)20min后再加試劑六。

3、反應(yīng)過程中注意避光。

4、若NAD+測定中△AA2-A1)≤0.0302,NADH測定中△AA2-A1)≤0.0222,說明樣本中輔酶含量較低,已低于檢測限,可做如下調(diào)整:(1)將測定管避光靜置時(shí)間20min延長到60min;(2)在提取階段增加取樣量,即取0.2g樣本或0.2mL樣本加入1mL提取液。

5、由于每一個(gè)測定管需要設(shè)一個(gè)對照管,本試劑盒100管保證測48個(gè)NAD+NADH.

 

NAD+NADH含量的計(jì)算

(一)      NAD+含量的計(jì)算

標(biāo)準(zhǔn)條件下的回歸曲線為y = 0.1475x + 0.0302,R2 = 0.9978;其中yA,xNAD+濃度nmol/mL

1、血清(漿)中NAD+含量計(jì)算

NAD+含量(nmol/mL=[(A -0.0302÷0.1475×V1) ]÷(V3×V1÷V2)=135.6×(A -0.0302

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中NAD+含量計(jì)算

(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算

NAD+ (nmol/mg prot=[(A -0.0302÷0.1475×V1)]÷(V1×Cpr)= 6.8×(A -0.0302÷Cpr

(2)按樣本鮮重計(jì)算

NAD+ (nmol/g 鮮重= [(A -0.0302÷0.1475×V1)]÷(W×V1÷V2)= 13.6×(A -0.0302÷W

 (3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

NAD+ (nmol/104 cell=[(A -0.0302÷0.1475×V1)]÷(500×V1÷V2)=0.027×(A -0.0302

 

(二)NADH含量的計(jì)算

標(biāo)準(zhǔn)條件下的回歸曲線為y = 0.1404x + 0.0222,R2 = 0.9976其中yA,xNADH濃度nmol/mL

1、血清(漿)中NADH含量計(jì)算

NADH含量(nmol/mL= [ (A -0.0222÷0.1404×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 142.5×(A -0.0222

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中NADH含量計(jì)算

(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算

NADH (nmol/mg prot= [ (A -0.0222÷0.1404×V1) ]÷(V1×Cpr)= 7.1×(A -0.0222÷Cpr

(2)按樣本鮮重計(jì)算

NADH (nmol/g 鮮重=[(A -0.0222÷0.1404×V1) ]÷(W×V1÷V2)= 14.2×(A -0.0222÷W

(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

NADH (nmol/104 cell= [ (A -0.0222÷0.1404×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.028×(A -0.0222

 

V1:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.02mL;V2加入提取液體積,2mLV3:加入血清(漿)體積:0.1mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL; W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500萬。

意:最di檢測限為0.1nmol/mL0.1nmol/g鮮重 0.001nmol/mg prot


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