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氨基比林-N-脫甲基酶(AND)活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)

發(fā)布時(shí)間:2023/3/29      點(diǎn)擊次數(shù):434

氨基比林-N-脫甲基酶(AND)活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)

                                                        微量法100/48

 

 

   :正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義:

細(xì)胞色素P450酶是一組在外源物質(zhì)代謝中,尤其是藥物和毒物,具有重要作用的酶系。AND作為P450酶系的重要一員,相當(dāng)于CYP3A4亞型,與藥物的去甲基化反應(yīng)密切相關(guān)。

 

測(cè)定原理:

AND催化氨基比林釋放甲醛,通過(guò)Nash比色法測(cè)定甲醛含量,即可計(jì)算出AND活性。

 

自備儀器和用品:

普通離心機(jī),超速離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液槍、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、蒸餾水、無(wú)水乙醇和冰。

 

試劑組成和配制:

試劑一:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加100mL蒸餾水充分溶解。

試劑二:液體×1瓶,4℃保存。

試劑三:粉劑×1管,4℃避光保存。臨用前加入1mL無(wú)水乙醇,充分溶解。

試劑四:粉劑×1管,4℃保存。臨用前加入0.5mL蒸餾水,充分溶解。

試劑五:粉劑×1瓶,室溫保存。臨用前加蒸餾水4mL充分溶解。

試劑六:液體×1瓶,室溫保存。

試劑七:液體×1瓶,4℃保存。

標(biāo)準(zhǔn)液:液體×1瓶,-20℃保存。臨用前取1.5mL EP 管,加入10μl標(biāo)準(zhǔn)液,加990μl蒸餾水,混勻即為0.05 mmol/L標(biāo)準(zhǔn)甲醛溶液,4℃保存。

 

粗酶液提?。?/span>

1除去細(xì)胞核,線粒體等大分子物質(zhì):稱(chēng)約0.5g組織,加入1 mL試劑一,冰上充分研磨,10 000g 4℃離心30min,取上清液轉(zhuǎn)入超速離心管。

2粗制微粒體:4℃,100 000g,離心60min,棄上清液。

3、除血紅蛋白等雜質(zhì):向步驟2的沉淀中加1mL試劑一,蓋緊后充分震蕩溶解,100 000g離心30min,棄上清液。

4、最終微粒體:向步驟3的沉淀中加試劑二0.5 mL,蓋緊后充分震蕩溶解,即粗酶液,待測(cè)。該待測(cè)液需當(dāng)天使用。

 

AND活性測(cè)定操作:

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到412 nm,蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑二置于37℃水浴中預(yù)熱30min。

3. 對(duì)照管:1EP管,加入10μL粗酶液,170μL試劑二,10μL試劑三,10μL蒸餾水,混勻后置于37℃

 

水浴保溫30min;立即加入35μL試劑五,混勻后置于冰浴中5min;取出后加入35μL試劑六,混勻后室溫靜置5min;室溫8000rpm離心5min;取新的EP管,加入100μL上清液,100μL試劑七,混勻后60℃水浴10min,然后取出,用冷水冷卻5min,于412nm測(cè)定光吸收,記為A對(duì)照管。

4. 測(cè)定管:1EP管,加入10μL粗酶液,170μL試劑二,10μL試劑三,10μL試劑四,混勻后置于37℃水浴保溫30min;立即加入35μL試劑五,混勻后置于冰浴中5min;取出后加入35μL試劑六,混勻后室溫靜置5min;室溫8000rpm離心5min;取1支新EP管,加入100μL上清液,100μL試劑七,混勻后60℃水浴10min,然后取出,用冷水冷卻5min,于412nm測(cè)定光吸收,記為A測(cè)定管。

5. 標(biāo)準(zhǔn)管:1EP管,加入100μL標(biāo)準(zhǔn)品,100μL試劑七,混勻后60℃水浴10min,然后取出,用冷水冷卻5min,于412nm測(cè)定光吸收,記為A標(biāo)準(zhǔn)管。

注意:每個(gè)樣品都需要做對(duì)照管。

 

AND活性計(jì)算:

a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1)按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義:37℃中每分鐘每毫克蛋白催化產(chǎn)生1nmol甲醛1個(gè)酶活單位。

AND活性(nmol/min/mg prot) = C標(biāo)準(zhǔn)品× V標(biāo)準(zhǔn)品×A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管× 稀釋倍數(shù)÷Cpr×V樣)÷T

= 45×A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管÷Cpr。

2)按樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義:37℃中每分鐘每克組織催化產(chǎn)生1nmol甲醛1個(gè)酶活單位。

AND活性(nmol/min/g 鮮重 ) = C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管×稀釋倍數(shù)÷(V÷V樣總×W)÷T

= 45×A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管÷W。

C標(biāo)準(zhǔn)品:0.05 mmol/L=50μmol/L;V標(biāo)準(zhǔn)品:500μL=0.0005 L;稀釋倍數(shù):V反總÷V上清液=50+850 +50+50+175+175÷500=2.7;Cpr:粗酶液蛋白質(zhì)濃度(mg/mL),需要另外測(cè)定,建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒;V樣:加入粗酶液體積,50μL=0.05mLV樣總:提取液體積,0.5mLT:催化反應(yīng)時(shí)間(min),30min

 

b.使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1)按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義:37℃中每分鐘每毫克蛋白催化產(chǎn)生1nmol甲醛1個(gè)酶活單位。

AND活性(nmol/min/mg prot) = C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管× 稀釋倍數(shù)÷Cpr×V樣)÷T

= 45×A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷ A標(biāo)準(zhǔn)管÷ Cpr

2)按樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義:37℃中每分鐘每克組織催化產(chǎn)生1nmol甲醛1個(gè)酶活單位。

AND活性(nmol/min/g 鮮重) = C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管×稀釋倍數(shù)÷(V÷V樣總×W)÷T

= 45×A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷ A標(biāo)準(zhǔn)管÷W。

C標(biāo)準(zhǔn)品:0.05 mmol/L=50μmol/L;V標(biāo)準(zhǔn)品:500μL=0.0005 L;稀釋倍數(shù):V反總÷V上清液=50+850 +50+50+175+175÷500=2.7;Cpr:粗酶液蛋白質(zhì)濃度(mg/mL),需要另外測(cè)定,建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒;V樣:加入粗酶液體積,50μL=0.05mL;V樣總:提取液體積,0.5 mL;T:催化反應(yīng)時(shí)間(min),30min

注意事項(xiàng):

1、粗酶液需在當(dāng)日完成測(cè)定,如需保存,則向粗酶液提取步驟3的沉淀中加0.5ml 20%的甘油,分裝后,-80℃保存;

2、試劑三和試劑四需臨用前配制,如當(dāng)天沒(méi)有用完,4℃避光保存,可用1周;

3、粗酶液可直接用于蛋白濃度測(cè)定,建議用BCA法測(cè)蛋白含量。


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