NAD激酶（NAD kinase, NADK）試劑盒說明書

                               微量法100管/48樣

注    意：正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：

NADK（EC 2.7.1.23）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，是目前所發(fā)現(xiàn)的生物體內(nèi)惟一能夠催化NAD+磷酸化生成NADP+的酶，可催化NAD(H)以ATP或無機多聚磷酸[poly(P)]作為磷?；w進行磷酸化反應，生成NADP(H)。因此，NAD激酶在合成NADP(H)以及調(diào)節(jié)NAD(H)與NADP(H)的平衡上具有重要作用。

測定原理：

NADK催化NAD⁺磷酸化，生成NADP⁺；NADP⁺可被6-磷酸葡萄糖脫氫酶還原為NADPH；在340 nm下測定NADPH增加速率。可反映出NADK活性的大小。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、恒溫水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：液體100 mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體10 mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：液體25 mL×1瓶，4℃保存；

試劑三：粉劑×1瓶，-20 ℃保存；

試劑四：粉劑×1瓶，-20℃保存；

樣本測定的準備：

1、細菌、細胞或組織樣品的制備：

細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1、分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、將試劑一和試劑二37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴15min以上。

3、工作液Ⅰ的配制：在試劑三中加入5mL試劑一，充分混勻待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；

   工作液Ⅱ的配制：在試劑四中加入18mL試劑二，充分混勻待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；

4、加樣表

充分混勻，37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴15min，立即煮沸

2min（蓋緊，防止水分散失）冰浴冷卻，10000g，25℃離心10min，取上清

加完試劑混勻，室溫靜置15min，340nm下測定吸光值，ΔA=A測定-A對照。

NADK活性計算：

a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、血清（漿）NADK活力的計算:

單位的定義：每mL血清（漿）每分鐘生成1 nmol的NADP定義為一個酶活力單位。

NADK（nmol/min/mL）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷V樣÷T=53.59×ΔA

2、組織、細菌或細胞中NADK活力的計算:

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol NADP定義為一個酶活力單位。

NADK（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=53.59×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol NADP定義為一個酶活力單位。

NADK（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=53.59×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘生成1 nmol NADP定義為一個酶活力單位。

NADK（nmol/min /10⁴ cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.107×ΔA

V反總：反應體系總體積，1×10^-4 L；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.02 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，15 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬。

b.  

c. 用96孔板測定的計算公式如下

1、血清（漿）NADK活力的計算:

單位的定義：每mL血清（漿）每分鐘生成1 nmol的NADP定義為一個酶活力單位。

NADK（nmol/min/mL）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷V樣÷T=107.18×ΔA

2、組織、細菌或細胞中NADK活力的計算:

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol NADP定義為一個酶活力單位。

NADK（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=107.18×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol NADP定義為一個酶活力單位。

NADK（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=107.18×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘生成1 nmol NADP定義為一個酶活力單位。

NADK（nmol/min /10⁴ cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.214×ΔA

V反總：反應體系總體積，1×10^-4 L；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：96孔板光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.02 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，15 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬。