磷脂酶D（ Phospholipases D，PLD ）試劑盒說明書

發(fā)布時(shí)間：2023/5/12

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磷脂酶D（ Phospholipases D，PLD ）試劑盒說明書

微量法100T/96S

注意 ：正式測定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義：

磷脂酶D（EC3.1.4.4）即磷脂酰膽堿水解酶，是催化磷酸二酯鍵水解和堿基交換反應(yīng)的一類酶的總稱，廣泛存在于高等動植物和細(xì)菌等多種生物體中，具有參與細(xì)胞脂質(zhì)代謝、信號傳導(dǎo)、生物膜形成的抗逆境脅等生理功能。

測定原理：

磷脂酶D催化水解磷脂酰膽堿末端的磷脂酰二酯鍵生成磷脂酸和膽堿，膽堿在膽堿氧化酶催化作用下生成甜菜堿和過氧化氫，過氧化氫在過氧化氫酶的作用下將4-氨基安替比林和重蒸酚氧化成粉紅色物質(zhì)，在500nm處有特征吸收峰。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：

天平、研缽、超速冷凍離心機(jī)、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋、無水乙醇。

試劑組成和配制：

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體102mL×瓶，4℃避光保存。

試劑二：液體3mL×1瓶，4℃避光保存。

試劑三：粉劑×1支，-20℃避光保存。臨用前加1mL無水乙醇充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑四：液體15mL×1瓶，4℃避光保存。

標(biāo)準(zhǔn)品：液體1mL×1支，4℃避光保存。

酶液提?。?/span>

1. 組織：按照質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴勻漿后于4℃，10000g離心5min，取全部上清于4℃、100000g離心30min，棄上清，取沉淀溶于1mL試劑一。

2. 細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后于4℃，10000g離心5min，取全部上清于4℃、100000g離心30min，棄上清，取沉淀溶于1mL試劑一。

3. 血清：直接測定。

測定操作：

	空白管	標(biāo)準(zhǔn)管	測定管
試劑一（μL）	20
試劑二（μL）	30	30	30
標(biāo)準(zhǔn)品（μL）		20
樣品（μL）			20
試劑三（μL）	10	10	10
充分混勻，30℃反應(yīng)30min，沸水浴1min，打開蓋子，自然冷卻2min。
試劑四（μL）	140	140	140
30℃反應(yīng)30min，于微量石英比色皿/96孔板，空白管調(diào)零，測定500nm處吸光值，分別記為A標(biāo)準(zhǔn)管和A測定管。

酶活計(jì)算公式

a. 用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下

1．按照蛋白濃度計(jì)算

酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘水解磷脂酰膽堿產(chǎn)生1nmol膽堿所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLD活性（nmol/min /mg prot）= ×C標(biāo)準(zhǔn)÷Cpr÷T= 16.7×÷Cpr

2．按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活性定義：每克組織每分鐘水解磷脂酰膽堿產(chǎn)生1nmol膽堿所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLD活性（nmol/min /g 鮮重）= ×C標(biāo)準(zhǔn)÷W÷T = 16.7×÷W

3．按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活性定義：每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘水解磷脂酰膽堿產(chǎn)生1nmol膽堿所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLD活性（nmol/min /10⁴ cell）= ×C標(biāo)準(zhǔn)÷細(xì)胞數(shù)量÷T = 16.7×÷細(xì)胞數(shù)量

4．按照液體體積計(jì)算

酶活性定義：每毫升血清每分鐘水解磷脂酰膽堿產(chǎn)生1nmol膽堿所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLD活性（nmol/min /mL）= ×C標(biāo)準(zhǔn)÷T=16.7×

C標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)品濃度，500nmol/mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g/mL；T：反應(yīng)時(shí)間，30min

b. 用96孔板測定的計(jì)算公式如下