線粒體檸檬酸（Mitochondrion citric acid, MCA）含量試劑盒說明書

                                微量法 100管/96樣

注   意 ：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

MCA是線粒體三羧酸循環(huán)的第一個(gè)中間產(chǎn)物，由檸檬酸合酶催化乙酰CoA與草酰乙酸合成，其含量是三羧酸循環(huán)強(qiáng)度的主要指標(biāo)之一。

配合測(cè)定丙酮酸含量、丙酮酸脫氫酶活性、乙酰CoA含量、檸檬酸合酶活性和MCA含量，其中（1）丙酮酸含量和丙酮酸脫氫酶活性變化可以反映糖酵解進(jìn)行程度，（2）綜合分析丙酮酸含量、丙酮酸脫氫酶活性和乙酰CoA含量變化可以反映脂肪酸β-氧化途徑提供的乙酰CoA情況，（3）乙酰CoA含量、檸檬酸合酶活性和MCA含量變化可以反映三羧酸循環(huán)進(jìn)行狀況。

測(cè)定原理：

MCA在檸檬酸裂解酶的作用下，生成α-酮酸（草酰乙酸）；在弱酸性條件下，α-酮酸進(jìn)一步與苯肼反應(yīng)，生成相應(yīng)的α-酮酸苯腙；α-酮酸苯腙在330nm處有吸收峰，該波長下吸光度的變化程度可反映出MCA的含量。

自備儀器和用品：

分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、可調(diào)式移液槍、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、研缽、蒸餾水。

試劑組成和配制：

酸性提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存。

堿性提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體6mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體2mL×1瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存；臨用前加入6mL蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑4℃保存；

標(biāo)準(zhǔn)液：液體1mL×1支，10μmol/mL檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)液，4℃保存。

線粒體中檸檬酸提取：

稱0.05~0.1g樣品（建議稱0.1g樣本），加入0.5mL酸性提取液，冰上充分研磨，600g/min 4℃離心5min；取上清至另一EP管中，11000g/min 4℃離心10min，棄上清（取300μL該上清液和300μL堿性提取液中和后可用于細(xì)胞質(zhì)CA含量測(cè)定）；沉淀即線粒體，向沉淀中加入0.5mL酸性提取液，充分懸浮溶解，超聲波破碎（功率20％，超聲3秒，間隔10秒，重復(fù)30次），取此溶液300μL和300μL堿性提取液中和，混勻，置冰上待測(cè)（不可用于蛋白質(zhì)含量測(cè)定）。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長到330nm，蒸餾水調(diào)零。

2、試劑一、二和三37℃預(yù)熱10min。

3、樣本測(cè)定：

空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需要各做一個(gè)。

充分混勻，330nm立即測(cè)定初始吸光值A1和37℃孵育30min后的吸光值A2，ΔA=A2 –A1。

檸檬酸含量計(jì)算：

（1）按蛋白濃度計(jì)算

檸檬酸含量(μmol/mg prot)=[C標(biāo)準(zhǔn)管×(ΔA測(cè)定管－ΔA空白管)÷(ΔA標(biāo)準(zhǔn)管－ΔA空白管) ×V樣]÷（V樣÷Cpr）=10×(ΔA測(cè)定管－ΔA空白管)÷(ΔA標(biāo)準(zhǔn)管－ΔA空白管)÷Cpr

蛋白質(zhì)含量需要另外測(cè)定。

（2）按樣本鮮重計(jì)算

檸檬酸含量(μ mol/g鮮重)=[C標(biāo)準(zhǔn)管×(ΔA測(cè)定管－ΔA空白管)÷(ΔA標(biāo)準(zhǔn)管－ΔA空白管) ×V樣]÷（W×V樣÷V樣總）=10×(ΔA測(cè)定管－ΔA空白管)÷(ΔA標(biāo)準(zhǔn)管－ΔA空白管)÷W

C標(biāo)準(zhǔn)管：標(biāo)準(zhǔn)液濃度，10μmol/mL； V樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積：0.06mL；V樣總：加入提取液體積：1mL；Cpr：樣品蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g。

注意：Z低檢測(cè)限為10nmol/mg prot或1μmol/g鮮重。