脫氫酶（dehydrogenase, DHA）試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法100管/96樣

注   意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

脫氫酶(dehydrogenase, DHA) 是一類(lèi)催化物質(zhì)氧化還原反應(yīng)的酶，催化底物通過(guò)細(xì)胞色素系統(tǒng)被氧化，釋放的能量供機(jī)體使用，是生物體取得能量的一種方式。

測(cè)定原理：

在細(xì)胞呼吸過(guò)程中，氫受體2, 3, 5 - 氯化三苯基四氮唑（2,3,5-Triphenyl Tetrazolium Chloride, TTC）在脫氫酶作用下接受氫以后，被還原為三苯基甲鐟（Triphenyl Formazone, TF），TF呈現(xiàn)紅色，于485nm測(cè)定其吸光值，即得脫氫酶活性。

自備實(shí)驗(yàn)儀器及用品：

篩子、天平、恒溫培養(yǎng)箱或水浴鍋、低溫離心機(jī)、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、冰、蒸餾水、甲醇（不允許快遞，請(qǐng)用戶自備）。

試劑的組成和配制：

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存

試劑一：粉劑×1瓶，使用前加10mL試劑二溶解，4℃避光保存（盡量現(xiàn)配現(xiàn)用）。

試劑二：液體20mL×1瓶，4℃保存。

試劑三：甲醇，自備。

樣品處理：

1.        細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。

2.        組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后8000g，4℃，離心20min。

3.        液體：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟和操作表：

脫氫酶活力計(jì)算：

a.        用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.0422x - 0.0312；R² = 0.9988；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μg/mL），y為吸光值。

1.按照蛋白濃度計(jì)算

酶活單位定義：在37℃時(shí)，每mg蛋白樣品每min催化產(chǎn)生1μgTF為一個(gè)酶活性單位。

DHA（μg/ min / mg prot）=（△A+0.0312）÷ 0.0422×V反總÷（Cpr×V樣）÷T= 0.181×（△A+0.0312）÷Cpr

2．按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活單位定義：在37℃時(shí)，每克樣品每min催化產(chǎn)生1μgTF為一個(gè)酶活性單位。

DHA（μg/ min /g 鮮重）=（△A+0.0312）÷ 0.0422×V反總÷（W×V樣÷V樣總）÷T= 0.181×（△A+0.0312）÷W

3. 按液體體積計(jì)算

酶活單位定義：在37℃時(shí)，每mL樣本每min催化產(chǎn)生1μgTF為一個(gè)酶活性單位。

DHA（μg/ min /mL）=（△A+0.0312）÷ 0.0422×V反總÷V樣÷T= 0.181×（△A+0.0312）

V反總：反應(yīng)總體積，1.1mL；V樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.1mL；T：培養(yǎng)時(shí)間，1d=1440min；W：樣品質(zhì)量，g；Cpr：蛋白濃度，mg/mL。

b. 用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.0211x - 0.0312；R² = 0.9988；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μg/mL），y為吸光值。

1.按照蛋白濃度計(jì)算

酶活單位定義：在37℃時(shí)，每mg蛋白樣品每min催化產(chǎn)生1μgTF為一個(gè)酶活性單位。

DHA（μg/ min / mg prot）=（△A+0.0312）÷ 0.0211×V反總÷（Cpr×V樣）÷T= 0.362×（△A+0.0312）÷Cpr

2．按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活單位定義：在37℃時(shí)，每克樣品每min催化產(chǎn)生1μgTF為一個(gè)酶活性單位。

DHA（μg/ min /g 鮮重）=（△A+0.0312）÷ 0.0211×V反總÷（W×V樣÷V樣總）÷T= 0.362×（△A+0.0312）÷W

3. 按液體體積計(jì)算

酶活單位定義：在37℃時(shí)，每mL樣本每min催化產(chǎn)生1μgTF為一個(gè)酶活性單位。

DHA（μg/ min /mL）=（△A+0.0312）÷ 0.0211×V反總÷V樣÷T= 0.362×（△A+0.0312）

V反總：反應(yīng)總體積，1.1mL；V樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.1mL；T：培養(yǎng)時(shí)間，1d=1440min；W：樣品質(zhì)量，g；Cpr：蛋白濃度，mg/mL。

注意事項(xiàng)：

配制好的試劑一避光保存于4℃，最好在一周內(nèi)使用，若出現(xiàn)紅色，則不能使用。