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己糖激酶(hexokinase,HK)試劑盒說明書

發(fā)布時(shí)間:2023/10/24      點(diǎn)擊次數(shù):390

己糖激酶(hexokinase,HK)試劑盒說明書

                                          微量法 100/96

 

   正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義

HKEC 2.7.1.1)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,是葡萄糖分解過程中的第一個(gè)關(guān)鍵酶,催化葡萄糖轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖,6-磷酸葡萄糖是糖酵解和磷酸戊糖途徑的交叉點(diǎn)。

 

測(cè)定原理

HK催化葡萄糖合成6-磷酸葡萄糖,6-磷酸葡萄糖脫氫酶進(jìn)一步催化6-磷酸葡萄糖脫氫生成NADPH,NADPH340nm有特征吸收峰。

 

需自備的儀器和用品

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、恒溫水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

 

試劑的組成和配制

提取液:100mL×1瓶,4保存;

試劑一:液體20mL×1瓶, 4保存;

試劑二:粉劑×1瓶,4保存;

試劑三:粉劑×1支,-20保存;

 

樣本的前處理

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):提取液體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次);8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。

2、組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。

3、血清(漿)樣品:直接檢測(cè)。

 

測(cè)定步驟

1、  分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm,蒸餾水調(diào)零。

2、  樣本測(cè)定

1)在試劑二中加入18mL試劑一充分溶解,置于37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃(其它物種)水浴5min;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。

2)在試劑三中加入1mL試劑一,充分溶解待用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。

3)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、10μL試劑三和180μL試劑二,混勻,立即記錄340nm20s時(shí)的吸光值A1 5min20s后的吸光值A2計(jì)算ΔA=A2-A1。

注意:不同勻漿組織中HK活力不一樣,做正式試驗(yàn)之前請(qǐng)做1-2只預(yù)試,若ΔA>0.5,則說明組織活力太

 

高,必須用提取液稀釋成適當(dāng)濃度勻漿上清液(計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)),或縮短反應(yīng)時(shí)間至2min,使ΔA<0.5,以提高檢測(cè)靈敏度。

 

HK活性計(jì)算

a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、血清(漿)HK活性

單位的定義:每毫升血清(漿)在每分鐘生成1 nmolNADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

HKnmol/min/mL)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷V÷T=643×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中HK活性

1)按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmolNADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

HKnmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(V×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr

2)按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義:每g組織每分鐘生成1 nmolNADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

HKnmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(W ×V÷V樣總) ÷T=643×ΔA÷W

3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義:每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成1 nmolNADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

HKnmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(500×V÷V樣總) ÷T=1.286×ΔA

V反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4 L;εNADPH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,5 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬。

 

b.96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、血清(漿)HK活性

單位的定義:每毫升血清(漿)在每分鐘生成1 nmolNADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

HKnmol/min/mL)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷V÷T=1286×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中HK活性

1)按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmolNADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

HKnmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(V×Cpr) ÷T=1286×ΔA÷Cpr

2)按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義:每g組織每分鐘生成1 nmolNADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

HKnmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(W× V÷V樣總) ÷T=1286×ΔA÷W

3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義:每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成1 nmolNADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

HKnmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(500×V÷V樣總)÷T=2.572×ΔA

V反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4 L;εNADPH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d96孔板光徑,0.5cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,5 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬。


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