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維生素B6(Vitamin B6,VB6)試劑盒說(shuō)明書(shū)

發(fā)布時(shí)間:2023/10/30      點(diǎn)擊次數(shù):392

維生素B6Vitamin B6,VB6)試劑盒說(shuō)明書(shū)

       微量法100T/96S

 

   :正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義:

維生素B6Vitamin B6又稱吡哆素,其包括吡哆醇、吡哆醛及吡哆胺,在體內(nèi)以磷酸酯的形式存在,是一種水溶性維生,在細(xì)胞中參與多種蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝,對(duì)生物體具有極其重要的作用。

 

測(cè)定原理:

VB64-氨基安替比林在強(qiáng)氧化劑作用下生成穩(wěn)定的黃色化合物,在390nm有特征吸收峰。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器:

天平、研缽、離心機(jī)、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋、蒸餾水。

 

試劑組成和配制

提取液:液體70mL×1瓶,4℃保存。

試劑一:液體1mL×1瓶,4℃保存。

試劑二:液體5mL×1瓶,4℃保存。

試劑三:液體8mL×1瓶,4℃避光保存。

試劑四:液體8mL×1瓶,4℃避光保存。

 

樣本處理:

1.        組織:將樣品磨碎,按照質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g,加入0.6mL提取液)加入提取液,60℃浸提30min,加蒸餾水0.4mL,混勻后于25℃,16000rpm離心10min,取上清測(cè)定(動(dòng)物組織等蛋白含量較高的樣本建議離心20-30分鐘)。

2.        細(xì)胞:按照細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):提取液體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬(wàn)細(xì)胞加入0.6mL提取液),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時(shí)間3min);加蒸餾水0.4mL,混勻后于25℃,16000rpm離心10min,取上清測(cè)定。

3.        血清:直接測(cè)定。               

 

測(cè)定操作:

 


空白管

測(cè)定管

樣品(μL


40

試劑一(μL

40


試劑二(μL

40

40

試劑三(μL

60

60

試劑四(μL

60

60

充分混勻,25℃反應(yīng)20min,于微量石英比色皿/96孔板,測(cè)定390nm處吸光值,記為A空白管和A測(cè)定管,△A=A測(cè)定管-A空白管??瞻坠苤灰鲆还堋?/span>

 

 

計(jì)算公式:
a.
用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線:y = 0.3635x+0.0205,R2 = 0.9986

1. 按照蛋白含量計(jì)算

VB6含量(μg/mg prot=(△A - 0.0205÷ 0.3635×V反總÷V×Cpr

                    = 13.76×(△A - 0.0205÷ Cpr

2. 按照樣本質(zhì)量計(jì)算

VB6含量(μg/g=(△A - 0.0205÷ 0.3635×V反總÷V×W÷V樣總)

                = 13.76×(△A - 0.0205÷ W

3. 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

VB6含量(μg/104 cell=(△A - 0.0205÷ 0.3635×V反總÷V×細(xì)胞數(shù)量÷V樣總)

                     = 13.76×(△A - 0.0205÷ 細(xì)胞數(shù)量

4. 按照液體體積計(jì)算

VB6含量(μg/mL=(△A - 0.0205÷ 0.3635×V反總÷V

                  = 13.76×(△A - 0.0205

V反總:反應(yīng)總體積,0.2mL;:V樣:加入樣本體積,0.04mL;V樣總:加入提取液體積,1mL; Cpr:蛋白濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g

 

b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線:y = 0.1818x+0.0205R2 = 0.9986

1. 按照蛋白含量計(jì)算

VB6含量(μg/mg prot=(△A - 0.0205÷ 0.1818×V反總÷V×Cpr

                    = 27.52×(△A - 0.0205÷ Cpr

2. 按照樣本質(zhì)量計(jì)算

VB6含量(μg/g=(△A - 0.0205÷ 0.1818 ×V反總÷V×W÷V樣總)

                = 27.52×(△A - 0.0205÷ W

3. 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

VB6含量(μg/104 cell=(△A - 0.0205÷ 0.1818×V反總÷V×細(xì)胞數(shù)量÷V樣總)

                     = 27.52×(△A - 0.0205÷ 細(xì)胞數(shù)量

4. 按照液體體積計(jì)算

VB6含量(μg/mL=(△A - 0.0205÷ 0.1818×V反總÷V

                  =27.52×(△A - 0.0205

V反總:反應(yīng)總體積,0.2mL;:V樣:加入樣本體積,0.04mL;V樣總:加入提取液體積,1mL; Cpr:蛋白濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g

 

注意事項(xiàng)

1.        若測(cè)定結(jié)果中吸光值超過(guò)1,請(qǐng)將樣本稀釋后進(jìn)行測(cè)定,并在計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。

2.        蛋白濃度較高的樣品,比如動(dòng)物組織,若顯色完成后有沉淀產(chǎn)生,將樣本稀釋后再測(cè)定,在計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。

3.        顯色完成后立即進(jìn)行測(cè)定。


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