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單寧酶(Tannase,TAN)試劑盒說(shuō)明書(shū)

發(fā)布時(shí)間:2023/11/6      點(diǎn)擊次數(shù):445

單寧酶(TannaseTAN試劑盒說(shuō)明書(shū)

                                       微量法100/48

 

 

   意 :正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義

單寧酶全稱是單寧酯酰水解酶(Tannase,EC 3.1.1.20),它可以水解沒(méi)食子酸單寧中的酯鍵和縮酚羧鍵,生成沒(méi)食子酸和葡萄糖。

 

測(cè)定原理

使用抗氧化劑沒(méi)食子酸丙酯(PG)作為單寧酶酶促反應(yīng)的底物,在270nn下測(cè)定底物PG反應(yīng)前后的光密度變化,計(jì)算單寧酶酶活力。

 

需自備的的儀器和用品

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96UV、研缽、冰、蒸餾水

 

試劑的組成和配制

試劑一:液體100mL×2瓶,4℃保存;

試劑二:粉劑×1支,4℃保存;臨用前每支加入6mL試劑一,充分溶解后備用;用不完的試劑4℃保存;

 

粗酶液提取

按照組織質(zhì)量(g):試劑一體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一),進(jìn)行冰浴勻漿。10000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。

液體樣本:直接取上清測(cè)定。

 

測(cè)定步驟

1、分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到270 nm,蒸餾水調(diào)零。

2、加樣表

試劑名稱(μL

對(duì)照管

測(cè)定管

95℃水浴5min后滅活的粗酶液

50


粗酶液


50

試劑二

50

50

混勻,40℃準(zhǔn)確保溫10 min后,置95℃水浴中10 min(蓋緊,防止水分散失),冷卻

試劑一

900

900

混勻,取200uL至微量石英比色皿或96UV板中,270nm處讀取各管吸光值。計(jì)算ΔA=A對(duì)照-A測(cè)定。每個(gè)測(cè)定管需設(shè)個(gè)一個(gè)對(duì)照管。

 

注意:

 

1.可以在不同對(duì)照管中加入不同樣品的粗酶液,然后集中進(jìn)行5min 95℃沸水浴處理。

2.務(wù)必使用96UV板(非普通酶標(biāo)板,普通酶標(biāo)板只能透過(guò)可見(jiàn)光,不能透過(guò)紫外光,檢測(cè)波長(zhǎng)小于340nm務(wù)必使用UV板)。

 

TAN活力單位的計(jì)算

a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸方程為y = 0.0058x + 0.0044,R2 = 0.9994xPG含量(µmol/L),y為吸光值。

1、按樣本體積計(jì)算

單位的定義:40℃下每毫升粗酶液每分鐘水解減少0.01µmol底物PG所需要的酶量定義為一個(gè)酶活單位。

TAN活性(µmol/min/mL)=(ΔA-0.0044÷0.0058÷1000×V反總÷0.01÷V÷T

=34.48×( ΔA-0.0044

2、按照蛋白濃度計(jì)算

單位的定義:40℃下每毫克蛋白每分鐘水解減少0.01µmol底物PG所需要的酶量定義為一個(gè)酶活單位(U)。

TAN活性((µmol/min/mg prot)=(ΔA-0.0044÷0.0058÷1000×V反總÷0.01÷(V×Cpr)÷T

=34.48×(ΔA-0.0044÷Cpr

3、按照樣本鮮重計(jì)算

單位的定義:40℃下每克樣品每分鐘水解減少0.01µmol底物PG所需要的酶量定義為一個(gè)酶活單位(U)。

TAN活性(µmol/min/g 鮮重)=(ΔA-0.0044÷0.0058÷1000×V反總÷0.01÷(V÷V樣總×W)÷T

=34.48×(ΔA-0.0044÷W

V反總:反應(yīng)體系總體積,1mL V樣:加入樣本體積,0.05mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,10minCpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g。

 

b.96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸方程為y = 0.0029x + 0.0044R2 = 0.9994;xPG含量(µmol/L),y為吸光值。

1、按樣本體積計(jì)算

單位的定義:40℃下每毫升粗酶液每分鐘水解減少0.01µmol底物PG所需要的酶量定義為一個(gè)酶活單位(U)。

TAN活性(µmol/min/mL)=(ΔA-0.0044÷0.0029÷1000×V反總÷0.01÷V÷T

=68.97×( ΔA-0.0044

2、按照蛋白濃度計(jì)算

單位的定義:40℃下每毫克蛋白每分鐘水解減少1µmol底物PG所需要的酶量定義為一個(gè)酶活單位(U)

TAN活性(µmol/min/mg prot)=(ΔA-0.0044÷0.0029÷1000×V反總÷0.01÷(V×Cpr)÷T

=68.97×( ΔA-0.0044÷Cpr

3、按照樣本鮮重計(jì)算

單位的定義:40℃下每克樣品每分鐘水解減少0.01µmol底物PG所需要的酶量定義為一個(gè)酶活單位(U)

TAN活性(µmol/min/g 鮮重)=(ΔA-0.0044÷0.0029÷1000×V反總÷0.01÷(V÷V樣總×W)÷T

=68.97×( ΔA-0.0044÷W

V反總:反應(yīng)體系總體積,1mL; V樣:加入樣本體積,0.05mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,10min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g


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