雞白痢/雞傷寒沙門氏菌（SP/SG）核酸檢測試劑盒（熒光 PCR 法）

【產(chǎn)品名稱】

商品名稱：雞白痢/雞傷寒沙門氏菌（SP/SG）核酸檢測試劑盒（熒光 PCR 法）

Name ：S.Gallinarum-Pullorum Nucleic Acid Detection Kit （Real-Time PCR Method）

【包裝規(guī)格】25T/盒、50T/盒

【預期用途】

由沙門氏菌屬的某些致病性沙門氏菌引起的雞群細菌性傳染病稱為雞沙門氏菌病，一般分為雞白痢、雞傷寒和副傷寒三種病型，其中以雞白痢和雞傷寒發(fā)病較多，危害較強。雞白痢是由雞白痢沙門氏菌（S.Pullorum）感染雞群引起的，主要是侵害雛雞。2 周以下的雛雞發(fā)病后死亡率可達 40%-70%，受感染的雛雞在 4-7 天死亡，急性時可在 1-3 天死亡。雞傷寒沙門氏菌（S.Gallinarum）感染雞群可引起雞傷寒病癥，主要是感染成年雞，雛雞有時也會被感染， 出殼后幾天開始發(fā)病， 死亡率較高。 現(xiàn)在， 這兩種致病菌統(tǒng)稱為雞- 雛沙門氏

（S.Gallinarum-Pullorum），沒有鞭毛，不會運動，只會感染雞群，可存在于卵巢、睪丸、肝臟等器官中，能夠通過親代感染子代，因此對養(yǎng)雞業(yè)的危害極大。

本試劑盒適用于肝臟、脾臟等組織樣品以及腸內(nèi)容物樣品，糞便樣品，泄殖腔拭子樣品等樣品中的雞白痢/      雞傷寒沙門氏菌，用于雞白痢/雞傷寒沙門氏菌感染的輔助診斷。

【檢驗原理】

本試劑盒采用 TaqMan 探針法實時熒光 PCR 技術，設計一對雞白痢/雞傷寒沙門氏菌特異性引物，結(jié)合一條特異性探針，用熒光 PCR 技術對雞白痢/雞傷寒沙門氏菌的 DNA 進行體外擴增檢測，用于臨床上對可疑感染病料的病原學診斷。

【試劑組成】

包裝規(guī)格25T/盒50T/盒

SP/SG 反應液500μL×1 管500μL×2 管

酶液25μL×1 管50μL×1 管

SP/SG 陽性質(zhì)控品50μL ×1 管50μL ×1 管

陰性質(zhì)控品250μL ×1 管250μL ×1 管

說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融次數(shù)不超過 5 次，有效期 12 個月。

【適用儀器】

ABI7500、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。

【標本采集】

組織樣品：選擇具有典型臨床癥狀的病死雞，無菌取其肝臟、脾臟等組織樣品，放置于無菌容器內(nèi)，標記好   組織名稱和采樣日期，冷藏運送到實驗室進行檢測。

肛拭子樣品：采集肛拭子樣品時，取無菌棉拭子插入畜禽肛-門或泄殖腔中，旋轉(zhuǎn) 2 圈~3 圈，刮取直腸黏液或糞便，放入裝有 30%甘油磷酸鹽緩沖液或半固體培養(yǎng)基中送檢。

腸內(nèi)容物樣品：取腸內(nèi)容物時，應燒烙腸壁表面，用吸管中扎穿腸壁。從腸腔內(nèi)吸取內(nèi)容物放入盛有滅菌的

30%甘油磷酸鹽緩沖液或半固體培養(yǎng)基中送檢或?qū)в屑S便的腸管兩端結(jié)扎，從兩端剪斷送檢。

糞便樣品：應選新鮮糞便至少 10g，運送糞便樣品可用帶螺帽容器或滅菌塑料袋，不得用帶皮塞的試管。

【保存和運輸】

采集或處理好的樣品在 2℃~8℃條件下保存應不超過 24 h；若需長期保存，應放置-70℃以下保存，凍融不超過 3 次。

【使用方法】

1.樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1樣本前處理

組織樣品：每份組織分別從不同的位置稱取樣品約 1g，手術剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中，8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中；水樣便 13000rpm 離心 2min，去盡上清；其它樣品處理參考 NY/T541-2016。

1.2核酸提取

推薦采用優(yōu)利科（上海）生命科學有限公司生產(chǎn)的核酸提取或純化試劑（磁珠法或離心柱法）進行核酸提取，請   按照試劑說明書進行操作。

2.試劑配制（試劑準備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設所需要的 PCR 反應管管數(shù)為 N（N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照；反應管數(shù)每滿 10 份，多配制 1 份），每測試反應體系配制如下表：

試劑SP/SG 反應液酶液

用量（樣本數(shù)為 N）19μL1μL

將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中，20μL/管。

3.加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的核酸、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 5μL，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

4.PCR 擴增（核酸擴增區(qū)）

4.1將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內(nèi)；

4.2設置好通道、樣品信息，反應體系設置為 25μL；

熒光通道選擇：檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列儀器請勿選擇 ROX

參比熒光，選擇 None 即可。

4.3推薦循環(huán)參數(shù)設置：

步驟循環(huán)數(shù)溫度時間收集熒光信號

11 cycle95℃2min否

245 cycles95℃15sec否

60℃30sec是

5.結(jié)果分析判定

5.1結(jié)果分析條件設定（請參照各儀器使用說明書進行設置，以分析 ABI7500 儀器為例）

反應結(jié)束后自動保存結(jié)果，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用戶可根據(jù)實際情況自行調(diào)整，Start 值可設在 3～15、End 值可設在 5～20，使閾值線位于擴增曲線指數(shù)期，陰性質(zhì)控品的擴增曲線平直或低于閾值線），點擊 Analyze 自動獲得分析結(jié)果。

5.2結(jié)果判斷

陽性：檢測通道 Ct 值≤40，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線； 陰性：樣本檢測結(jié)果 Ct 值>40 或無 Ct 值。

5.3質(zhì)控標準

陰性質(zhì)控品：無特異性擴增曲線或無 Ct 值顯示；

陽性質(zhì)控品：擴增曲線有明顯指數(shù)增長期，且 Ct 值≤32； 以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。

6.檢測方法的局限性

1.樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關；

2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；

3.陽性對照、擴增產(chǎn)物泄漏，會導致假陽性結(jié)果；

4.病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結(jié)果；

5.不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結(jié)果；

6.試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準確的結(jié)果；

7.本檢測結(jié)果僅供參考，如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。

【注意事項】

1.所有操作嚴格按照說明書進行；

2.試劑盒內(nèi)各種組分使用前應自然融化，完-全混勻并短暫離心；

3.反應液應避光保存；

4.反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服；

6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行，以免交叉污染；

7.實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

8.試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通則》進行處理。

【參考文獻】

[1] 國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局. GB/T 40049-2021 雞腸炎沙門氏菌 PCR 檢測方法[S]