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禽偏肺病毒(aMPV)核酸檢測試劑盒說明書

發(fā)布時間:2024/11/4      點擊次數(shù):245

【產(chǎn)品名稱】

商品名稱:禽偏肺病毒(aMPV)核酸檢測試劑盒(熒光 PCR 法)

Name:Avian Metapneumovirus Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】50T/盒

【預期用途】

禽偏肺病毒(Avian Metapneumovirus, aMPV)主要引起火雞和雞的上呼吸道或中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病,如火雞鼻氣管炎(TRT)和肉雞腫頭綜合征(SES)。目前 aMPV 有 4 個亞型,其中 A、B 亞型在世界各地均有報道,C亞型和 D 亞型分別在美國和法國報道。

本試劑盒適用于檢測肺臟、氣管和鼻竇組織以及呼吸道、眼鼻分泌物等標本中禽偏肺病毒核酸,適用于禽偏肺病毒感染的輔助診斷。

【檢驗原理】

本試劑盒根據(jù)禽偏肺病毒基因保守區(qū)設計特異性引物和熒光探針,用一步法熒光 RT-PCR 技術對禽偏肺病毒核酸進行體外擴增檢測,用于臨床上對可疑感染病料的病原學診斷。

【試劑組成】

包裝規(guī)格50T/盒

aMPV 反應液500μL×2 管

酶液50μL×1 管

aMPV 陽性質控品50μL ×1 管

陰性質控品250μL ×1 管

說明:不同批號的試劑盒組分不可交互使用

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃,避光保存、運輸、反復凍融次數(shù)不超過 5 次,有效期 12 個月。

【適用儀器】

ABI7500、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。

【標本采集】

病死或撲殺禽,取肺臟、氣管或鼻竇組織;待檢活禽,用棉拭子取眼鼻或呼吸道分泌物,放于 1mL 50%甘油生理鹽水中。

【保存和運輸】

采集或處理好的樣品在 2℃~8℃條件下保存應不超過 24 h;若需長期保存,應放置-70℃以下保存,凍融不超過 3 次。

【使用方法】

1.樣品處理(樣本處理區(qū))

1.1樣本前處理

組織樣品:稱取約 1g,手術剪剪碎混勻后于研磨器中研磨,加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨,待勻漿后轉至 1.5mL 滅菌離心管中,8000rpm 離心 2min,取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中;棉拭子直接取 100μL 于1.5mL 滅菌離心管中。

1.2核酸提取

推薦采用優(yōu)利科(上海)生命科學有限公司生產(chǎn)的核酸提取或純化試劑(磁珠法或離心柱法)進行核酸提取,請    按照試劑說明書進行操作。

2.試劑配制(試劑準備區(qū))

根據(jù)待檢測樣本總數(shù),設所需要的 PCR 反應管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照;反應管數(shù)每滿 10 份,多配制 1 份),每測試反應體系配制如下表:

試劑aMPV 反應液酶液

用量19μL1μL

將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中,20μL/管。

3.加樣(樣本處理區(qū))

將步驟 1 提取的核酸、陽性質控品、陰性質控品各取 5μL,分別加入相應的反應管中,蓋好管蓋,混勻, 短暫離心。

4.PCR 擴增(核酸擴增區(qū))

4.1將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內;

4.2設置好通道、樣品信息,反應體系設置為 25μL;

熒光通道選擇:檢測通道(ReporterDye)FAM,淬滅通道(QuencherDye)NONE,ABI 系列儀器請勿選擇 ROX

參比熒光,選擇 None 即可。

4.3推薦循環(huán)參數(shù)設置:

步驟循環(huán)數(shù)溫度時間收集熒光信號

11 cycle50℃10min

21 cycle95℃2min

345 cycles95℃15sec

60℃30sec

5.結果分析判定

5.1結果分析條件設定(請參照各儀器使用說明書進行設置,以分析 ABI7500 儀器為例)

反應結束后自動保存結果,根據(jù)分析后圖像調節(jié) Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值(用戶可根據(jù)實際情況自行調整,Start 值可設在 3~15、End 值可設在 5~20,使閾值線位于擴增曲線指數(shù)期,陰性質控品的擴增曲線平直或低于閾值線),點擊 Analyze 自動獲得分析結果。

5.2結果判斷

陽性:檢測通道 Ct 值≤40,且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線; 陰性:樣本檢測結果 Ct 值>40 或無 Ct 值。

5.3質控標準

陰性質控品:無特異性擴增曲線或無 Ct 值顯示;

陽性質控品:擴增曲線有明顯指數(shù)增長期,且 Ct 值≤32; 以上條件應同時滿足,否則實驗視為無效。

6.檢測方法的局限性

1.樣本檢測結果與樣本收集、處理、運送以及保存質量有關;

2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染,會出現(xiàn)假陽性結果;

3.陽性對照、擴增產(chǎn)物泄漏,會導致假陽性結果;

4.病原體在流行過程中基因突變、重組,會導致假陰性結果;

5.不同的提取方法存在提取效率差異,會導致假陰性結果;

6.試劑運輸,保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降,出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準確的結果;

7.本檢測結果僅供參考,如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段。

【注意事項】

1.所有操作嚴格按照說明書進行;

2.試劑盒內各種組分使用前應自然融化,wan全混勻并短暫離心;

3.反應液應避光保存;

4.反應中盡量避免氣泡存在,管蓋需蓋緊;

5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服;

6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行,以免交叉污染;

7.實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器;

8.試劑盒里所有物品應視為污染物對待,并按照《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通則》進行處理。

【參考文獻】

[1]王艷,莊金秋,梅建國,等.禽偏肺病毒檢測方法研究進展[J].動物醫(yī)學進展,2015.

[2]陳琳,刁有祥,鄒金峰.禽偏肺病毒 RT-PCR 檢測方法的建立及應用[J].中國獸醫(yī)學報,2012.

[3]Manual O I E T. Chapter 3. 3. 15. Foot and mouth disease (infection with foot and mouth disease virus). Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2018[J].


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