商品名稱：鴿瘟（PPMV-1）核酸檢測試劑盒（熒光 PCR 法））

Name：Pigeon Paramyxovirus type 1 Detection Kit（Real-Time PCR Method）

【包裝規(guī)格】25T/盒、50T/盒

【預期用途】

鴿瘟是由鴿 1 型副黏病毒( Pigeon paramyxovirus type 1, PPMV-1)引起的一種高度接觸性傳染病，引起的臨床癥狀與雞新城疫非常相似，主要表現(xiàn)為扭頭歪脖、癱瘓等神經(jīng)癥狀和腹瀉、排綠色稀糞等消化道癥狀。

本試劑盒適用于檢測腦、肺、牌、腎、腸(包括內(nèi)容物)、氣管、肝、心等組織、口咽和泄殖腔拭子等標本中   鴿 1 型副黏病毒 RNA，適用于鴿 1 型副黏病毒感染的輔助診斷。

【檢驗原理】

本試劑盒采用 TaqMan 探針法實時熒光 PCR 技術(shù)，設計一對鴿 1 型副黏病毒特異性引物，結(jié)合一條特異性探針，用熒光 PCR 技術(shù)對鴿 1 型副黏病毒的 RNA 進行體外擴增檢測，用于臨床上對可疑感染病料的病原學診斷。

【試劑組成】

包裝規(guī)格25T/盒50T/盒

PPMV-1 反應液500μL×1 管500μL×2 管

酶液25μL×1 管50μL×1 管

PPMV-1 陽性質(zhì)控品50μL ×1 管50μL ×1 管

陰性質(zhì)控品250μL ×1 管250μL ×1 管

說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融不超過 5 次，有效期 12 個月。

【適用儀器】

ABI7500、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。

【標本采集】

病死或撲殺鴿子，取腦、肺、脾、腎、腸（包括內(nèi)容物）、氣管、肝、心等組織臟器；待檢活鴿子，用拭子采集口咽和泄殖腔拭子，放入盛有 2.0mL 的 PBS（0.01mol/L、pH7.0~7.4，含青霉素 2000U/mL、鏈霉素 2mg/mL、10%甘油）的采樣管。

【保存和運輸】

采集或處理好的樣品在 2℃~8℃條件下保存應不超過 24 h；若需長期保存，應放置-70℃以下保存，凍融不超過 3 次。

【使用方法】

1.樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1樣品前處理

每份組織用無菌的剪刀和攝子剪取待檢樣品，置組織勻漿器充分研磨，置于含抗生素的 PBS(0.01moL/L、pH7.0~7.4)中，制成濃度為 10%~20%的懸浮液，凍融 2 次~3 次,室溫(20℃~25℃)靜置 1h~2h，3000r/min 離心 5min，取上清液轉(zhuǎn)入無菌的 1.5mL 離心管中；拭子樣品在振蕩器上充分混合后，將拭子中的液體充分擠壓后棄去拭子， 室溫靜置作用 30min，3000r/min 離心 5min，取上清液轉(zhuǎn)入無菌的 1.5mL 離心管中。

1.2核酸提取

推薦采用優(yōu)利科（上海）生命科學有限公司生產(chǎn)的核酸提取或純化試劑（磁珠法或離心柱法）進行核酸提取，請   按照試劑說明書進行操作。

2.試劑配制（試劑準備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設所需要的 PCR 反應管管數(shù)為 N（N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照；反應管數(shù)每滿 10 份，多配制 1 份），每測試反應體系配制如下表：

試劑PPMV-1 反應液酶液

用量19μL1μL

將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中，20μL/管。

3.加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的核酸、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 5μL，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

4.PCR 擴增（核酸擴增區(qū)）

4.1將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內(nèi)；

4.2設置好通道、樣品信息，反應體系設置為 25μL；熒光通道選擇：檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅

通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列儀器請勿選擇 ROX 參比熒光，選擇 None 即可。

4.3推薦循環(huán)參數(shù)設置：

步驟循環(huán)數(shù)溫度時間收集熒光信號

11 cycle50℃10min否

21 cycle95℃2min否

345 cycles95℃15sec否

60℃30sec是

5.結(jié)果分析判定

5.1結(jié)果分析條件設定（請參照各儀器使用說明書進行設置，以分析 ABI7500 儀器為例）

反應結(jié)束后自動保存結(jié)果，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用戶可根據(jù)實際情況自行調(diào)整，Start 值可設在 3～15、End 值可設在 5～20，使閾值線位于擴增曲線指數(shù)期，陰性質(zhì)控品的擴增曲線平直或低于閾值線），點擊 Analyze 自動獲得分析結(jié)果。

5.2結(jié)果判斷

陽性：檢測通道 Ct 值≤40，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線；陰性：樣本檢測結(jié)果 Ct 值>40 或無 Ct 值。

5.3質(zhì)控標準

陰性質(zhì)控品：無特異性擴增曲線或無 Ct 值顯示；陽性質(zhì)控品：擴增曲線有明顯指數(shù)增長期，且 Ct 值≤32； 以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。

6.檢測方法的局限性

1.樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關(guān)；

2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；

3.陽性對照、擴增產(chǎn)物泄漏，會導致假陽性結(jié)果；

4.病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結(jié)果；

5.不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結(jié)果；

6.試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準確的結(jié)果；

7.本檢測結(jié)果僅供參考，如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。

【注意事項】

1.所有操作嚴格按照說明書進行；

2.試劑盒內(nèi)各種組分使用前應自然融化，完-全混勻并短暫離心；

3.反應液應避光保存；

4.反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服；

6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行，以免交叉污染；

7.實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

8.試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通則》進行處理。