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NADP蘋果酸酶(NADP-ME)試劑盒

簡要描述:NADP蘋果酸酶(NADP-ME)試劑盒測定原理:
NADP-ME催化NADP+還原成NADPH,在340nm下測定NADPH增加速率。

  • 更新時間:2024-06-29
  • 廠商性質(zhì):生產(chǎn)廠家
  • 生產(chǎn)地址:上海
  • 訪  問  量:716

詳細介紹

品牌YLKBIOCAS詳見說明書
分子式詳見說明書純度詳見說明書
分子量詳見說明書貨號YLK-SH124
規(guī)格100管/96樣、50管/48樣供貨周期現(xiàn)貨
主要用途科研應用領域化工,生物產(chǎn)業(yè)
測定方法:微量法、紫外分光光度法

NADP蘋果酸酶(NADP-ME)試劑盒說明書

                                          微量法100/96

 

   意 : 正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義:

ME廣泛存在于微生物、培養(yǎng)細胞、動物和植物胞漿中,尤其在植物組織中活性較高。ME催化蘋果酸氧化脫羧的可逆反應,產(chǎn)生丙酮酸和CO2,以及伴隨NAD(P)+的還原反應,是蘋果酸代謝的關鍵酶。ME活性與生物合成和抗氧化密切相關。近年來植物ME活性測定較多,已經(jīng)成為抗氧化研究的熱點。根據(jù)輔酶專一性和對底物特異性的不同,可將ME分為NAD-ME(EC1.1.1.38)NADP-ME(EC1.1.1.40)

 

測定原理:

NADP-ME催化NADP+還原成NADPH,在340nm下測定NADPH增加速率。

 

需自備的儀器和用品:

紫外分光光度計/酶標儀、水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板和蒸餾水。

 

試劑的組成和配制:

提取液:100mL×1瓶,4保存。;

試劑一:液體30mL×1瓶,4℃保存;

試劑二:粉劑×1瓶,-20℃保存; 臨用前加入20mL試劑充分振蕩,溶解待用,用不完的試劑分裝后-20度保存,禁止反復凍融。

試劑三:粉劑×1瓶,-20℃保存;臨用前加入2.5mL蒸餾水充分振蕩,溶解待用,用不完的試劑分裝后-20度保存,禁止反復凍融。

 

樣本的前處理:

1、細菌、細胞或組織樣品的制備:

細菌或培養(yǎng)細胞:先收集細菌或細胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細菌或細胞數(shù)量(104個):提取液體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復30次);14000g 4離心10min,取上清,置冰上待測。

組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。14000g 4離心10min,取上清,置冰上待測。

2、血清(漿)樣品:直接檢測。

 

測定步驟:

1、  分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至340nm,蒸餾水調(diào)零。

2、在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本和170μL試劑二,混勻,30℃孵育5min,加入20μL試劑三,混勻后立即記錄340nm處初始吸光值A1 1min后的吸光值A2,計算ΔA=A2-A1。

 

NADP-ME活性計算:

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1)按樣本蛋白濃度計算:

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個酶活力單位。

NADP-MEnmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(V×Cpr) ÷T= 3215×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。

2)按樣本鮮重計算:

單位的定義:每g組織每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個酶活力單位。

NADP-MEnmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(W× V÷V樣總) ÷T = 3215×ΔA÷W

3)按細菌或細胞密度計算:

單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個酶活力單位。

NADP-MEnmol/min/104 cell=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(500×V÷V樣總) ÷T =6.43×ΔA

V反總:反應體系總體積,2×10-4 L;εNADPH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應時間,1 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g500:細菌或細胞總數(shù),500萬。

 

b.96孔板測定的計算公式如下

1)按樣本蛋白濃度計算:

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個酶活力單位。

NADP-MEnmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(Cpr×V) ÷T= 6431×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。

2)按樣本鮮重計算:

單位的定義:每g組織每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個酶活力單位。

NADP-MEnmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(V÷V樣總×W) ÷T = 6431×ΔA÷W

3)按細菌或細胞密度計算:

單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個酶活力單位。

NADP-MEnmol/min/104 cell=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(V÷V樣總×500) ÷T =12.86×ΔA

V反總:反應體系總體積,2×10-4 L;εNADPH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol/cm;d96孔板光徑,0.5cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應時間,1 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細菌或細胞總數(shù),500萬。


NADP蘋果酸酶(NADP-ME)試劑盒僅供科研!

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