天花病毒探針法熒光定量PCR試劑盒

商品名稱：天花病毒探針法熒光定量PCR試劑盒

Name     ：Variola Virus(VARV) Probe qPCR Kit

天花病毒(Variola Virus，VARV) 會引起天花，是一種烈性傳染病，感染天花病毒后的潛伏期平均約為12天，感染后的初期癥狀包括：高燒、疲累、頭疼、心跳加速及背痛。2-3天后，會有典型的天花紅疹明顯地分布在臉部、手臂和腿部。在發(fā)疹的初期，還會有淡紅色的塊狀面積伴隨疹子而出現(xiàn)。病灶在幾天之后開始化膿，直到第2個星期開始結(jié)痂。接下來的3-4周慢慢發(fā)展成疥癬，然后慢慢剝落。該病毒會對人體健康有較大影響，因此天花病毒的快速準(zhǔn)確鑒定對該病的預(yù)防和檢疫有著重要作用。

因此快速檢測天花病毒具有重要意義。本產(chǎn)品就是以探針法熒光定量 PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測天花病毒的試劑盒，它具有下列特點：

1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。

2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性高。

3. 提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。

4. 特異性高，引物是根據(jù)天花病毒通用高度保守區(qū)設(shè)計。

5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應(yīng)。

6. 本產(chǎn)品只能用于科研。

【試劑組成】

【儲存條件及有效期】

低溫運輸、-20℃保存，有效期一年。

【自備試劑】樣品 DNA。

【使用方法】

一、稀釋PCR 陽性對照（以10E1-10E6 拷貝/μL 這6個10倍稀釋度為例）

如果做定性實驗，則此步可以跳過。如果做定量實驗，則需要稀釋陽性對照做標(biāo)準(zhǔn)曲線。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分。本產(chǎn)品只提供 DNA 片段作為陽性對照。

1.  標(biāo)記 6 個離心管，分別為 6，5，4，3，2，1。

2.         用帶芯槍頭分別加入 45μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液（最好用帶芯槍頭，下同）。

3.         在 6 號管中加入 5μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照（試劑盒提供），充分震蕩 1 分鐘， 得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

4.         換槍頭，在 5 號管中加入 5μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

5.         換槍頭，在 4 號管中加入 5μL 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照（上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E4 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

6.         重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上用。

二、樣品 DNA 的制備

7.         如果有 N 個樣品，必須設(shè)置 N+2 個提取，多出的一個是樣品制備 PC（樣品制備陽性對照），一個是樣品制備 NC（樣品制備陰性對照）。可以用 10μL 陽性對照的 10000 倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為樣品制備 PC。另外用水作為樣品制備 NC。

8.         用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù) DNA/提取試劑盒兼容。

二、Probe qPCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）

9.         如果做定量分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9個PCR 管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6個用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1個用于PCR陰性對照（用水做模板），1個用于 PCR 陽性對照（用第4號管中的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為描述操作步驟，在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè) 置陽性對照，并且陽性對照

10.         樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）：

數(shù)據(jù)處理

12.         如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

     13.    如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于 35。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實驗的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 40，則為陽性。