鼠疫桿菌(YP)核酸檢測試劑盒(熒光-PCR 法)

產(chǎn)品名稱：鼠疫桿菌(YP)核酸檢測試劑盒(熒光-PCR 法)

英文名稱：Yersinia Pestis Detection Kit (Real-Time PCR Method)

鼠疫是由鼠疫耶爾森氏菌（Yersinia Pestis, YP）,簡稱鼠疫桿菌，引起危害人類健康的烈性傳染病之一，具有傳染性強、傳播迅速、疫情嚴重、死亡率高等特點， 為國際檢疫傳染病。

本試劑盒適用于檢測動物腺、肝、脾、肺組織及人痰、血液等標本中分離出的鼠疫桿菌，用于鼠疫桿菌的輔助診斷。

本試劑盒采對鼠疫桿菌基因設計特異性的引物和探針，用熒光 PCR 技術對鼠疫桿菌的核酸進行體外擴增檢測，用于臨床上對可疑感染者的病原學診斷。

【試劑組成】

說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用。

【適用儀器】

ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。

【注意事項】

1.  樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1  樣本前處理

組織樣品：稱取組織樣品約 0.5g，置于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨，勻漿后取 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中；

痰、尿液等液體樣品：取 100μL 于滅菌離心管中；

血液樣品：取抗凝血下層血細胞 50μL，加入 100μL 雙蒸水吹勻。

1.2  DNA 提取

1)  對上述處理好的標本加入 50μL 核酸提取液，100℃恒溫處理 10min，13,000

rpm 離心 5min，取上清液轉(zhuǎn)移至新的 1.5mL EP 管，-20℃保存；

2)  DNA 的提取也可以采用我公司生產(chǎn)的 DNA/提取試劑盒

（離心柱提取法），請嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

2.  試劑配制（試劑準備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設所需要的 PCR 反應管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照；樣品每滿 7 份，多配制 1 份)，每測試反應體系配制如下表：

將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中，21uL/管。

3.  加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的 DNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

4.  PCR 擴增（核酸擴增區(qū)）

4.1 將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內(nèi)；

4.2 設置好通道、樣品信息，反應體系設置為 25μL；

熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）

NONE，請勿選擇 ROX 參比熒光。

1.1 推薦循環(huán)參數(shù)設置：

2.  結果分析判定

2.1  結果分析條件設定

設置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機器自動分析的結果分析，當曲線出現(xiàn)整體傾斜時，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結果。

2.2  結果判斷

陽性：檢測通道 Ct 值≤35.0，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線。

可疑：檢測通道 Ct 值>35.0，且出現(xiàn)明顯擴增曲線的樣本建議重復試驗，重復試驗結果出現(xiàn) Ct 值≤35.0 和明顯擴增曲線者為陽性，否則為陰性。

陰性：樣本檢測結果無 Ct 值且無明顯的擴增曲線。

3.  檢測方法的局限性

? 樣本檢測結果不樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關；

? 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結果；

? 陽性對照、擴增產(chǎn)物泄漏，會導致假陽性結果；

? 病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結果；

? 不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結果；

? 試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準確的結果。

4.  質(zhì)控標準

陰性質(zhì)控品：無明顯擴增曲線或無 Ct 值顯示；

陽性質(zhì)控品：擴增曲線有明顯指數(shù)生長期，且 Ct 值≤32； 以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。

【注意事項】

? 所有操作嚴格按照說明書進行；

? 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應自然融化，wan全混勻并短暫離心；

? 反應液應避光保存；

? 反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

? 使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)與用工作服；

? 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行，以免交叉污染；

? 實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

? 試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通則》進行處理。

【參考文獻】

[1]   國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.SN/T 1280-2003 國境口岸鼠疫檢驗規(guī)程[S].北京:科學出版社, 2003.

[2]   張志凱, 海榮, 蔡虹, 等. 鼠疫耶爾森菌的多重 PCR 檢測方法[J]. 中國媒介生物學及控制雜志, 2007.

[3]   吉林省質(zhì)量技術監(jiān)督局. DB22/T 2081-2014 鼠疫耶爾森菌核酸的測定-熒光PCR 方法[S].