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143B人骨肉瘤細胞培養(yǎng)說明書

發(fā)布時間:2023/3/6      點擊次數(shù):1076

細胞介紹

胸苷激酶陰性(TK-)。這是一個人骨肉瘤細胞系

細胞特性

1)  來源:

2)  形態(tài):混合型,成纖維與上皮樣 貼壁生長

3)  含量:>1x106  細胞數(shù)

4)  規(guī)格:T25瓶或者1mL凍存管包裝

5)  用途:僅供科研使用。

 

運輸和保存:干冰運輸及復蘇好存活細胞:(11mL凍存管包裝干冰運輸,收到后-80度冰箱保存過夜后轉(zhuǎn)入液氮或直接復蘇,若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細胞有污染,請立即與我們聯(lián)系。(2T25瓶復蘇的存活細胞常溫發(fā)貨,收到后按照細胞接收后的處理方法操作。

細胞接收后的處理:

1)收到細胞后,75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h,若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損、有液溢出及細胞有污染,請拍照后及時聯(lián)系我們。

2)請在45X顯微鏡下確認細胞狀態(tài),同時給剛收到的細胞拍照(10×,20×)2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存,作為售后時收到時細胞狀態(tài)的依據(jù)。

3)貼壁細胞:細胞在37℃培養(yǎng)箱中放置2-3h,顯微鏡下觀察細胞的生長和貼壁情況,有些貼壁細胞在快遞運送過程中會因振動脫落和脫落后成團的情況。若鏡下觀察細胞的生長密度若在60%以下,可去除培養(yǎng)瓶中灌液培養(yǎng)基(若有未貼壁的細胞需要離心回收,重懸打入到原培養(yǎng)瓶中),加入新配制的wan全培養(yǎng)基6-8mL,放到細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。若細胞生長密度達70%-80%以上,可以對細胞進行傳代處理。傳代過程中,若因運輸振動脫落的細胞需要離心回收。

4備注:運輸用的培養(yǎng)基(灌液培養(yǎng)基)不能再用來培養(yǎng)細胞,請換用按照說明書細胞培養(yǎng)條件新配制的wan全培養(yǎng)基來培養(yǎng)細胞。  收到細胞后第一次傳代建議T25培養(yǎng)瓶12傳代 。                  

 

一.培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備:

1) 準備MEM養(yǎng)基 88 %,優(yōu)質(zhì)胎牛血清10 %,MEM NEAA非必需氨基酸1%P/S青霉素-鏈霉素1%

2)培養(yǎng)條件: 氣相:空氣,95%;二氧化碳,5%。 溫度:37攝氏度,培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

2) 凍存液:90%血清,10%DMSO,現(xiàn)用現(xiàn)配。

二. 細胞處理:

1)凍存細胞的復蘇::

將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍,加入到含4-6mLwan全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min,棄去上清液,wan全培養(yǎng)基重懸細胞。然后將細胞懸液加入含6-8mlwan全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶(或皿)中37℃培養(yǎng)過夜。第二天顯微鏡下觀察細胞生長情況和細胞密度。

2)細胞傳代:如果細胞密度達80%-90%,即可進行傳代培養(yǎng)。

對于貼壁細胞傳代可以參考以下方法:

1. 棄去培養(yǎng)上清,用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

2. 加入0.25%(w / v)胰蛋白酶-0.53 mM EDTA培養(yǎng)瓶中T251-2mL,T752-3mL,置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘(難消化的細胞可以適當延長消化時間),然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況,若細胞大部分變圓并脫落,迅速拿回操作臺,輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml10%FBS的培養(yǎng)基來終止消化。

3. 輕輕打勻后吸出,在1000RPM件下離心3-5min,棄去上清液,補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。將細胞懸液按12的比例分到新T25瓶中,添加6-8ml按照說明書要求配置的新的wan全培養(yǎng)基以保持細胞的生長活力,后續(xù)傳代根據(jù)實際情況按1:2~1:5的比例進行。

3)細胞凍存: 收到細胞后建議在培養(yǎng)前3代時凍存一批細胞種子以備后續(xù)實驗使用。下面T25瓶為例;

1. 細胞凍存時按照細胞傳代的過程收集消化好的細胞到離心管中,可使用血球計數(shù)板計數(shù),來決定細胞的凍存密度。一般細胞的推薦凍存密度為1×106~1×107個活細胞/ml.

2. 1000rpm離心3-5min,去掉上清。用配制好的細胞凍存液重懸細胞 ,按每1ml凍存液含1×106~1×107個活細胞/ml分配到一個凍存管中將細胞分配到凍存管中,標注好名稱、代數(shù)、日期等信息。

3. 將要凍存的細胞置于程序降溫盒中,-80度冰箱中過夜,之后轉(zhuǎn)入液氮容器中儲存。同時記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用。

 

注意事項:

1. 所有動物細胞均視為有潛在的生物危害性,必須在二級生物安全臺內(nèi)操作,并請注意防護,所有廢液及接觸過此細胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。

2. 建議在復蘇凍存細胞時始終使用防護手套、衣服和戴上防護面罩。注意:凍存管浸沒在液氮中會泄漏,并會慢慢充滿液氮。解凍時,液氮轉(zhuǎn)化成氣相可能導致容器爆炸或用危險力吹掉其蓋子,從而產(chǎn)生飛揚的碎屑造成人員傷害。


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