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脲酶(Urease, UE)測定試劑盒說明書

發(fā)布時間:2023/4/6      點擊次數(shù):466

脲酶(Urease, UE)測定試劑盒說明書

                                    微量法100/48

   意:正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義:

UE能夠水解尿素,產(chǎn)生氨和碳酸。UE活性與有機物質(zhì)含量、全氮和速效氮含量呈正相關(guān),反應(yīng)了氮素狀況。

測定原理:

利用靛酚藍比色法測定脲酶水解尿素產(chǎn)生的NH3-N。

需自備的儀器和用品:

可見分光光度計/酶標儀、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰、甲苯(不允許快遞)和蒸餾水。

試劑的組成和配制:

提取液:液體60mL×1瓶,4保存;

試劑一:粉劑×1瓶,臨用前加入9mL蒸餾水,充分溶解待用,4保存;用不完的試劑4保存;

試劑二:液體22mL×1瓶,4保存;

試劑三A液:液體×1支,4保存;試劑三B液:液體×1瓶,4保存;臨用前將A液倒入B液中混合,待用;用不完的試劑4保存一周;

試劑四:液體2mL×1瓶,4保存;

樣本的前處理

1、細菌、細胞或組織樣品的制備:

細菌或培養(yǎng)細胞:先收集細菌或細胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細菌或細胞數(shù)量(104個):提取液體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次);8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測。

組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測。

2、血清(漿)樣品:直接檢測。

測定步驟:

1、  分光光度計或酶標儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至578nm,蒸餾水調(diào)零。

2、酶促反應(yīng)

試劑名稱

測定管

對照管

樣本(μL

20

20

試劑一(μL

90


蒸餾水(μL


90

試劑二(μL

190

190

混勻,放入37水浴1h后,10000g 25離心10min,取上清液。

2、將上清液稀釋10倍(取0.1mL上清液,加入0.9mL蒸餾水)。

3、測氨量(在微量石英比色皿或96孔板中加入下列試劑)


測定管

對照管

稀釋后的上清液(μL

80

80

試劑三(μL

15

15

試劑四(μL

15

15

充分混勻,室溫放置20min

蒸餾水(μL

90

90

混勻,于578nm處,蒸餾水調(diào)零,讀吸光值A,計算ΔA=A測定管-A對照管。每個測定管設(shè)一個對照管。

UE活力計算

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

標準條件下測定的回歸方程為y = 0.0915x +0.0373x為標準品濃度(μg/mL),y吸光值A

1、血清(漿)UE活力的計算:

單位的定義:每mL血清(漿)每分鐘產(chǎn)生1μg NH3-N定義為一個酶活力單位。

UE活力(μg/min/mL(ΔA-0.0373) ÷0.0915×10×V反總÷V÷T=27.32×(ΔA -0.0373)

單位的定義:每天g土樣中產(chǎn)生1μg NH3-N定義為一個酶活力單位。

2、組織、細菌或細胞中1μg NH3-N活力的計算:

1)按樣本蛋白濃度計算:

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1μg NH3-N定義為一個酶活力單位。

UE活力(μg/min/mg prot)=(ΔA-0.0373) ÷0.0915×10×V反總÷(V×Cpr)÷T =27.32×(ΔA -0.0373) ÷Cpr

2)按樣本鮮重計算:

單位的定義:每g組織每分鐘產(chǎn)生1μg NH3-N定義為一個酶活力單位。

UE活力(μg/min/ g 鮮重)=(ΔA-0.0373) ÷0.0915×10×V反總÷(W× V÷V樣總)÷T =27.32×(ΔA -0.0373) ÷W

3)按細菌或細胞密度計算:

單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘產(chǎn)生1μg NH3-N定義為一個酶活力單位。

UE活力(μg/min/104 cell)=(ΔA-0.0373) ÷0.0915×10×V反總÷(500×V÷V樣總) ÷T=0.0546×ΔA

10:稀釋倍數(shù);T:反應(yīng)時間,60min; V反總:反應(yīng)體系總體積:0.3mL;V樣:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.02mL;V樣總:提取液體積,1mLCpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL; W:樣本質(zhì)量, g;500:細菌或細胞總數(shù),500萬。

b.96孔板測定的計算公式如下

標準條件下測定的回歸方程為y = 0.04575x +0.0373x為標準品濃度(μg/mL),y吸光值A。

1、血清(漿)UE活力的計算:

單位的定義:每mL血清(漿)每分鐘產(chǎn)生1μg NH3-N定義為一個酶活力單位。

UE活力(μg/min/mL(ΔA-0.0373) ÷0.04575×10×V反總÷V÷T=54.64×(ΔA -0.0373)

單位的定義:每天g土樣中產(chǎn)生1μg NH3-N定義為一個酶活力單位。

2、組織、細菌或細胞中1μg NH3-N活力的計算:

1)按樣本蛋白濃度計算:

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1μg NH3-N定義為一個酶活力單位。

UE活力(μg/min/mg prot)=(ΔA-0.0373) ÷0.04575×10×V反總÷(V×Cpr)÷T =54.64×(ΔA -0.0373) ÷Cpr

2)按樣本鮮重計算:

單位的定義:每g組織每分鐘產(chǎn)生1μg NH3-N定義為一個酶活力單位。

UE活力(μg/min/g 鮮重)=(ΔA-0.0373) ÷0.04575×10×V反總÷(W× V÷V樣總)÷T =54.64×(ΔA -0.0373) ÷W

3)按細菌或細胞密度計算:

單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘產(chǎn)生1μg NH3-N定義為一個酶活力單位。

UE活力(μg/min/104 cell)=(ΔA-0.0373) ÷0.04575×10×V反總÷(500×V÷V樣總) ÷T=0.1092×ΔA

10:稀釋倍數(shù);T:反應(yīng)時間,60min; V反總:反應(yīng)體系總體積:0.3mLV樣:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.02mL;V樣總:提取液體積,1mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL; W:樣本質(zhì)量, g;500:細菌或細胞總數(shù),500萬。



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