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磷酸丙糖異構(gòu)酶(Triose-phosphate isomerase,TPI)試劑盒說明書

發(fā)布時(shí)間:2023/10/25      點(diǎn)擊次數(shù):400

磷酸丙糖異構(gòu)酶(Triose-phosphate isomerase,TPI)試劑盒說明書

                                                     微量法100T/96S

 

注   意 :正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義:

植物葉綠體中磷酸丙糖異構(gòu)酶是光合作用中參與calvin循環(huán)的重要酶。作用于磷酸甘油醛和磷酸二羥丙酮之間的轉(zhuǎn)化,磷酸二羥丙酮能快速透過葉綠體的包膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),并在其中逐步轉(zhuǎn)化為蔗糖。

 

測(cè)定原理:

磷酸丙糖異構(gòu)酶將磷酸二羥丙酮轉(zhuǎn)化為3-磷酸甘油醛,3-磷酸甘油醛與NAD在3-磷酸甘油醛脫氫酶的作用下生成3-磷酸甘油酸和NADH,340nm處的吸光度變化反映了磷酸丙糖異構(gòu)酶的活性的高低。

 

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器:

天平、低溫離心機(jī)、研缽、震蕩儀、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板。

 

試劑組成和配制:  

提取液一:液體100mL×1瓶,4℃保存。

提取液二:液體100mL×1瓶,4℃保存。

試劑一:液體12mL×1瓶,4℃保存。

試劑二:粉劑×1瓶,-20℃避光保存。臨用前加2mL蒸餾水充分溶解;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。

試劑三:粉劑×1瓶,-20℃避光保存。臨用前加2 mL蒸餾水充分溶解;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。

試劑四:粉劑×1瓶,-20℃避光保存。臨用前加2 mL蒸餾水充分溶解;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。

 

酶液提取:

①總TPI酶提?。航ㄗh稱取約0.1g樣本,加入1mL提取液一,冰浴勻漿后超聲破碎(冰浴,200W,破碎3s,間歇7s,總時(shí)間1min),然后4℃,8000g離心10min,取上清測(cè)定。

②胞漿和葉綠體TPI酶的分離:按照植物組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g樣本,加入1mL提取液一),冰浴勻漿后于4℃,200g離心5min,棄沉淀,取上清在4℃,8000g離心10min,取上清用于測(cè)定胞漿TPI酶活性,取沉淀加1mL提取液二,震蕩溶解后超聲破碎(冰浴,200W,破碎3s,間歇7s,總時(shí)間1min),然后4℃,8000g離心10min,取上清測(cè)定葉綠體中TPI酶活性。

建議測(cè)定總TPI酶活性,按照步驟①提取粗酶液,若需要分別測(cè)定胞漿和葉綠體中的TPI,則按照步驟②提取粗酶液。

 

測(cè)定操作:

1.        分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm,蒸餾水調(diào)零。

 

2.  取微量石英比色皿/96孔板,依次加入120μL試劑一,20μL試劑二,20μL試劑三,20μL試劑四,20μL粗酶液,充分混勻,記錄340nm處10s的吸光值A(chǔ)1和310s的吸光值A(chǔ)2,△A=A2-A1

 

 

計(jì)算公式:

a.        用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

(1)按照樣本蛋白濃度計(jì)算

酶活單位定義:每毫克組織蛋白每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

TPI(nmol/min/mg prot)= ΔA÷(ε×d)×V反總÷(V樣×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr

(2)按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活單位定義:每克組織每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

TPI(nmol/min/g 鮮重)= ΔA÷(ε×d)×V反總÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=321.54×ΔA÷W

V反總:反應(yīng)體系總體積,0.2mL;ε:NADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.02mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;T:反應(yīng)時(shí)間,5 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g

 

b.       用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

(1)按照樣本蛋白濃度計(jì)算

酶活單位定義:每毫克組織蛋白每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

TPI(nmol/min/mg prot)= ΔA÷(ε×d)×V反總÷(V樣×Cpr) ÷T= 643.08×ΔA÷Cpr

(2)按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活單位定義:每克組織每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

TPI(nmol/min/g 鮮重)= ΔA÷(ε×d)×V反總÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T= 643.08×ΔA÷W

V反總:反應(yīng)體系總體積,0.2mL;ε:NADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,0.5cm;V樣:加入樣本體積,0.02mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;T:反應(yīng)時(shí)間,5 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g


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