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丙酮酸含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)

發(fā)布時(shí)間:2023/10/25      點(diǎn)擊次數(shù):424

丙酮酸(pyruvic acid PA含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)

                                          微量法100/96

 

    意:正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義:

丙酮酸通過(guò)乙酰CoA連接葡萄糖、脂肪酸和氨基酸三大代謝,起著重要的樞紐作用。

 

測(cè)定原理:

丙酮酸與2,4-er硝ji苯肼作用,生成丙酮酸-2,4-er硝基苯腙,在堿性溶液中呈顯色。

需自備的儀器和用品:

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰、蒸餾水。

 

試劑的組成和配制:

提取液:液體100mL×1瓶,4保存;

試劑一:液體2.5mL×1瓶, 4保存;

試劑二:液體12.5mL×1瓶, 4保存。

 

丙酮酸提取:

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):提取液體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液),超聲波破碎(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次),靜置30min, 8000g,25℃離心10min,取上清待測(cè)。

2、組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進(jìn)行冰浴勻漿,靜置30min8000g,25℃離心10min,取上清待測(cè)。

3、血清(漿)樣品按照血清(漿)體積(mL):提取液體積(mL)15~10的比例(建議0.1mL血清(漿)加入1mL提取液),進(jìn)行冰浴勻漿,靜置30min, 8000g25℃離心10min,取上清待測(cè)。

測(cè)定步驟:

1、  分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至520nm,蒸餾水調(diào)零。

2、在微量石英比色皿或96孔板中加入75μL樣本25μL試劑一,混勻,靜置2min,加入125μL試劑二,混勻,于520nm波長(zhǎng)處測(cè)定管吸光值A。

 

丙酮酸含量計(jì)算:

a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸方程為y = 0.0466x + 0.0675; x為丙酮酸含量(µg/mL),y為吸光值。

2、按照血清(漿)體積計(jì)算

丙酮酸含量(μg/mL= [(A-0.0675)÷0.0466×V1]÷V3×V1÷V2=214.6×(A-0.0675)

3、按照蛋白濃度計(jì)算

丙酮酸含量(μg/mg prot=[(A-0.0675)÷0.0466×V1]÷(V1×Cpr)=21.46×(A-0.0675) ÷Cpr

4、按照樣品質(zhì)量計(jì)算

丙酮酸含量(µg/g鮮重)= [(A-0.0675)÷0.0466×V1]÷(W ×V1÷V2=21.46×(A-0.0675) ÷W

 

3、按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

丙酮酸含量(μg/104 cell)=[(A-0.0675)÷0.0466×V1]÷500×V1÷V2=0.043×(A-0.0675)

V1:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.075mL;V2:加入提取液體積,1 mL;V3:加入血清(漿)體積,0.1 mL; Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mLW:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬(wàn)。

 

b. 96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸方程為y = 0.0233x + 0.0675; x為丙酮酸含量(µg/mL),y為吸光值。

2、按照血清(漿)體積計(jì)算

丙酮酸含量(μg/mL= [(A-0.0675)÷0.0233×V1]÷V3×V1÷V2=429.2×(A-0.0675)

3、按照蛋白濃度計(jì)算

丙酮酸含量(μg/mg prot=[(A-0.0675)÷0.0233×V1]÷(V1×Cpr)=42.92×(A-0.0675) ÷Cpr

4、按照樣品質(zhì)量計(jì)算

丙酮酸含量(µg/g鮮重)= [(A-0.0675)÷0.0233×V1]÷(W ×V1÷V2=42.92×(A-0.0675) ÷W

3、按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

丙酮酸含量(μg/104 cell)=[(A-0.0675)÷0.0233×V1]÷500×V1÷V2=0.086×(A-0.0675)

V1:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.075mL;V2:加入提取液體積,1 mL;V3:加入血清(漿)體積,0.1 mL Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mLW:樣本質(zhì)量,g500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬(wàn)。

注意:Z低檢測(cè)限為1μg/mL1μg/g鮮重或10ng/mg prot


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