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丙酮酸激酶(Pyruvate kinase,PK)試劑盒說明書

發(fā)布時間:2023/10/25      點擊次數(shù):403

丙酮酸激酶(Pyruvate kinase,PK)試劑盒說明書

                                          微量法100/96

 

 

   正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義

PKEC 2.7.1.40廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,催化糖酵解過程中的最后一步反應(yīng),是糖酵解過程中的主要限速酶之一,也是產(chǎn)生ATP的關(guān)鍵酶之一,因此測定PK活性具有重要意義。

 

測定原理

PK催化磷酸烯醇式丙酮酸和ADP生成ATP和丙酮酸,乳酸脫氫酶進一步催化NADH和丙酮酸生成乳酸和NAD+,在340nm下測定NADH下降速率,即可反映PK活性。

需自備的儀器和用品

紫外分光光度計/酶標(biāo)儀、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水

 

試劑的組成和配制

提取液:100mL×1瓶,4保存;

試劑一:液體20mL×1瓶,4保存;;

試劑二:粉劑×2瓶,-20保存;

試劑三:液體10μL×2支,4保存;

 

樣本的前處理

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個):提取液體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次);8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測。

2、組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測。

3、血清(漿)樣品:直接檢測。

 

測定步驟

1、  分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至340nm,蒸餾水調(diào)零。

2、  樣本測定

1)試劑二的配制:臨用前取試劑二一瓶,加入9mL試劑一和1.06mL蒸餾水充分溶解,置于37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)水浴5min現(xiàn)配現(xiàn)用。

2)試劑三的配制:臨用前取試劑三一支,加入0.6mL蒸餾水充分溶解待用;現(xiàn)配現(xiàn)用。

3)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、10μL試劑三和180μL試劑二,混勻,立即記錄340nm20s時的吸光值A1 2min20s后的吸光值A2,計算ΔA=A1-A2。

 

 

PK活性計算

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、血清(漿)中PK活力的計算:

單位的定義:每毫升血清(漿)每分鐘消耗1 nmolNADH定義為一個酶活力單位。

PKnmol/min/mL)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷V÷T=1608×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中PK活力的計算:

1)按樣本蛋白濃度計算:

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmolNADH定義為一個酶活力單位。

PKnmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(V×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr

2)按樣本鮮重計算:

單位的定義:每g組織每分鐘消耗1 nmolNADH定義為一個酶活力單位。

PKnmol/min /g 鮮重)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(W× V÷V樣總)÷T=1608×ΔA÷W

3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算:

單位的定義:每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1 nmolNADH定義為一個酶活力單位。

PKnmol/min /104 cell)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(500×V÷V樣總)÷T=3.216×ΔA

V反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4 L;εNADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mLT:反應(yīng)時間,2min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬。

 

b. 96孔板測定的計算公式如下

1、血清(漿)中PK活力的計算:

單位的定義:每毫升血清(漿)每分鐘消耗1 nmolNADH定義為一個酶活力單位。

PKnmol/min /mL)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷V÷T=3216×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中PK活力的計算:

1)按樣本蛋白濃度計算:

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmolNADH定義為一個酶活力單位。

PKnmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(V×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr

2)按樣本鮮重計算:

單位的定義:每g組織每分鐘消耗1 nmolNADH定義為一個酶活力單位。

PKnmol/min /g 鮮重)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(W× V÷V樣總)÷T=3216×ΔA÷W

3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算:

單位的定義:每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1 nmolNADH定義為一個酶活力單位。

PKnmol/min /104 cell)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(500×V÷V樣總)÷T=6.432×ΔA

V反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4 LεNADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d96孔板光徑,0.5cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時間,2min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬。


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