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乳酸含量(lactic acid,LA)試劑盒說明書

發(fā)布時(shí)間:2023/10/26      點(diǎn)擊次數(shù):412

乳酸含量(lactic acid,LA)試劑盒說明書

微量法 100T/48S

 

 

   正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義:

乳酸是生物體代謝過程中重要的中間產(chǎn)物,與糖代謝、脂類代謝、蛋白質(zhì)代謝及細(xì)胞內(nèi)能量代謝密切相關(guān),乳酸含量是評(píng)估糖元代謝的和有氧代謝的重要指標(biāo)。

 

測(cè)定原理

乳酸在乳酸脫氫酶的作用下生成丙酮酸,同時(shí)使NAD+還原生成NADH H+,H+傳遞給PMS

生成的 PMSH2 還原 INT 生成紅色物質(zhì),在 530nm 處有特征吸收峰。

 

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器

天平、研缽、離心機(jī)、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板、恒溫水浴鍋。

 

試劑組成和配制:

提取液:液體 110mL×1 瓶,4℃保存。

試劑一:液體 2mL×1 瓶,4℃保存。

試劑二:液體 5mL×1 瓶,4℃保存。

試劑三:粉劑×1 支,-20℃避光保存。臨用前加入 0.6mL 蒸餾水充分溶解。

試劑四:粉劑×1 瓶,4℃避光保存。臨用前加 6mL 蒸餾水充分溶解。

試劑五:粉劑×1 支,4℃避光保存。標(biāo)準(zhǔn)品:液體 1mL×1 支,4℃保存。

顯色液:臨用前根據(jù)用量按照提取液(V):試劑三(V):試劑四(V):試劑五(m=1mL) 0.3mL)3mL)15mg)的比例充分混勻。(注意:現(xiàn)配現(xiàn)用,用多少配多少,在棕色瓶中配制,試劑盒中帶有 4 個(gè)棕色空瓶)

 

樣本處理

1.    組織:按照質(zhì)量(g):提取液體積(mL) 15~10 的比例(建議稱取約 0.1g,加入 1mL

提取液)加入提取液,冰浴勻漿后于 4℃,12000g 離心 10min,取上清測(cè)定。

2.    細(xì)胞:按照細(xì)胞數(shù)量(104 個(gè)):提取液體積(mL)為 500~10001  的比例(建議 500萬細(xì)胞加入 1mL 提取液),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率 300w,超聲 3 秒,間隔 7 秒,總時(shí)間 3min);于 4℃,12000g 離心 10min,取上清測(cè)定。

3. 血清:直接測(cè)定。

 

測(cè)定操作:


樣品對(duì)照管

樣品測(cè)定管

標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照管

標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定管

樣品(μL

10

10



標(biāo)準(zhǔn)品(μL



10

10

H2OμL

60

90

60

90

試劑一(μL

30


30


試劑二(μL

40

40

40

40

顯色液(μL

60

60

60

60

 

:標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照料管和標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定管只需測(cè)定一次,每個(gè)樣品測(cè)定管設(shè)一個(gè)樣品對(duì)照管。

 

計(jì)算公式

1.按照蛋白含量計(jì)算

LA 含量(μmol/mg prot= A 樣÷△A 標(biāo)×C 標(biāo)÷ Cpr

= 2×△A 樣÷△A 標(biāo)÷ Cpr

2.按照樣本質(zhì)量計(jì)算

LA 含量(μmol/g 鮮重)= A 樣÷△A 標(biāo)×C 標(biāo)÷ W

= 2×△A 樣÷△A 標(biāo)÷ W

3.按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

LA 含量(μmol/104 cell= A 樣÷△A 標(biāo)×C 標(biāo)÷ 細(xì)胞數(shù)量

= 2×△A 樣÷△A 標(biāo)÷ 細(xì)胞數(shù)量

4.按照液體體積計(jì)算

LA 含量(μmol/mL= A 樣÷△A 標(biāo)×C 標(biāo)

= 2×△A 樣÷△A 標(biāo)

C 標(biāo):標(biāo)準(zhǔn)品濃度,2mmol/L;W:樣本質(zhì)量,g/mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL

 

注意事項(xiàng):

1.若吸光值超過 2,請(qǐng)進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂尯笤龠M(jìn)行測(cè)定,并在計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。

2.Z低檢出限為 1.8μmol/L。


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