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脫氫抗壞血酸(dehydroascorbate,DHA)含量測定試劑盒說明書

發(fā)布時(shí)間:2023/10/29      點(diǎn)擊次數(shù):423

脫氫抗壞血酸dehydroascorbateDHA含量測定試劑盒說明書

                                                      微量法100T/96S

 

    意:正式測定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義:

AsA作為植物細(xì)胞一個(gè)重要生理指標(biāo),其AsA 的含量、氧化還原狀態(tài)(AsA/DHA 比率)及其合成與代謝相關(guān)酶類活性的變化涉及植物對一系列環(huán)境脅迫的響應(yīng)。DHAAsA的可逆的氧化型,在生物體內(nèi),與抗壞血酸共同組成氧化還原系統(tǒng),具有電子受體的作用。

 

測定原理:

DTT還原DHA生成AsA,通過測定體系中AsA的生成速率,即可計(jì)算出DHA含量。

自備儀器和用品:

低溫離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板(UV板)、可調(diào)式移液器、研缽、冰和蒸餾水。

 

試劑組成和配制:

試劑一:液體100 mL×1瓶,室溫保存。

試劑二:液體16mL×1瓶,室溫保存。

試劑三:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加入5mL蒸餾水充分溶解。

標(biāo)準(zhǔn)品:粉劑×1瓶, 4℃保存。臨用前加入5.743 mL蒸餾水充分溶解;吸取0.1 mL上述溶液,加入0.9 mL蒸餾水,混勻,即為100μmol/L DHA。

 

樣品中DHA提?。?/span>

1.        組織:按照組織質(zhì)量(g:試劑一體(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進(jìn)行冰浴勻漿。12000g,4離心20min,取上清置冰上待測。

2. 細(xì)菌、真菌:按照細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):試劑一體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細(xì)胞加入1mL試劑一),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時(shí)間3min);12000g,4℃離心10min,取上清液置于冰上待測。

3. 血清等液體:直接測定。

 

DHA測定操作:

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min,調(diào)節(jié)波長到265 nm,蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑二在25℃水浴鍋中預(yù)熱30 min

3. 標(biāo)準(zhǔn)管:依次在微量石英比色皿/96孔板加入20μL標(biāo)準(zhǔn)液、160μL預(yù)熱的試劑二和20μL試劑三,迅速混勻后于265nm比色,記錄10s130s的吸光值A1A2A空白管=A2-A1。

4. 測定管:依次在微量石英比色皿/96孔板加入20μL上清液、160μL預(yù)熱的試劑二和20μL試劑三,迅速混勻后于265nm比色,記錄10s130s的吸光值A3A4,A測定管=A4-A3。

注意:標(biāo)準(zhǔn)管只需測定一次。

 

計(jì)算公式:

 

a.使用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下

(1). 按蛋白濃度計(jì)算

DHA(nmol/mg prot) =[C標(biāo)準(zhǔn)液×A測定管÷A標(biāo)準(zhǔn)管×V標(biāo)準(zhǔn)Cpr×V

=100×A測定管÷A標(biāo)準(zhǔn)管÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算

DHA(nmol/g 鮮重) =[C標(biāo)準(zhǔn)液×A測定管÷A標(biāo)準(zhǔn)管×V標(biāo)準(zhǔn)]÷(W×V÷V樣總)

=100×A測定管÷A標(biāo)準(zhǔn)管÷W

(3). 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

DHA(nmol/104 cell) =[C標(biāo)準(zhǔn)液×A測定管÷A標(biāo)準(zhǔn)管×V標(biāo)準(zhǔn)]÷(W×V÷V樣總)

=100×A測定管÷A標(biāo)準(zhǔn)管÷細(xì)胞數(shù)量

4)按液體體積計(jì)算

DHA(nmol/mL) =[C標(biāo)準(zhǔn)液×A測定管÷A標(biāo)準(zhǔn)管×V標(biāo)準(zhǔn)]÷V

=100×A測定管÷A標(biāo)準(zhǔn)管

C標(biāo)準(zhǔn)液:100μmol/L;V樣總:上清液總體積,1.0 mL=1 ×10-3 L;V標(biāo)準(zhǔn):加入標(biāo)準(zhǔn)品體積,0.02mL;V樣:加入樣本體積,0.02mLCpr:上清液蛋白質(zhì)濃度,mg/mLW:樣品質(zhì)量(g)。

 

b.使用96孔板測定的計(jì)算公式如下

(1). 按蛋白濃度計(jì)算

DHA(nmol/mg prot) =[C標(biāo)準(zhǔn)液×A測定管÷A標(biāo)準(zhǔn)管×V標(biāo)準(zhǔn)Cpr×V

=100×A測定管÷A標(biāo)準(zhǔn)管÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算

DHA(nmol/g 鮮重) =[C標(biāo)準(zhǔn)液×A測定管÷A標(biāo)準(zhǔn)管×V標(biāo)準(zhǔn)]÷(W×V÷V樣總)

=100×A測定管÷A標(biāo)準(zhǔn)管÷W

(3). 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

DHA(nmol/104 cell) =[C標(biāo)準(zhǔn)液×A測定管÷A標(biāo)準(zhǔn)管×V標(biāo)準(zhǔn)]÷(W×V÷V樣總)

=100×A測定管÷A標(biāo)準(zhǔn)管÷細(xì)胞數(shù)量

4)按液體體積計(jì)算

DHA(nmol/mL) =[C標(biāo)準(zhǔn)液×A測定管÷A標(biāo)準(zhǔn)管×V標(biāo)準(zhǔn)]÷V

=100×A測定管÷A標(biāo)準(zhǔn)管

C標(biāo)準(zhǔn)液:100μmol/L;V樣總:上清液總體積,1.0 mL=1×10-3 LV標(biāo)準(zhǔn):加入標(biāo)準(zhǔn)品體積,0.02mLV樣:加入樣本體積,0.02mLCpr:上清液蛋白質(zhì)濃度,mg/mLW:樣品質(zhì)量(g)。

 

注意事項(xiàng):

1.        臨用前配制的試劑未使用完的4保存,3天內(nèi)使用完。

2.        Z低檢出限為10μmol/L。


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