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單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)試劑盒說(shuō)明書

發(fā)布時(shí)間:2023/10/30      點(diǎn)擊次數(shù):382

單脫氫抗壞血酸還原酶MDHAR活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書

                                                   微量法100T/96S

 

    意:正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義:

MDHAR催化MDHA還原生成AsA,在抗壞血酸氧化還原代謝中具有重要作用。

 

測(cè)定原理:

MDHAR 催化 NADH 還原MDHA 生成 AsANAD+NADH340 nm有特征吸收峰,但是NAD+沒(méi)有。通過(guò)測(cè)定340 nm光吸收下降速率,來(lái)計(jì)算出MDHAR活性。

 

實(shí)驗(yàn)中所需儀器及設(shè)備:

研缽、冰、臺(tái)式離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍和雙蒸水

 

試劑組成和配置:

試劑一:液體100mL×1瓶,4℃保存。

試劑二:液體20mL×1瓶,室溫保存。

試劑三:粉劑×1瓶(棕色),4℃保存。臨用前加入3 mL蒸餾水充分溶解。

試劑四:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加入2.5 mL蒸餾水充分溶解。

試劑五:液體15μL×1瓶,4℃保存。臨用前加3 mL試劑二充分溶解。

 

粗酶液提?。?/span>

1.        組織:按照組織質(zhì)量(g:試劑一體(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進(jìn)行冰浴勻漿。8000g,4離心10min,取上清置冰上待測(cè)。

2.        . 細(xì)菌、真菌:按照細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):試劑一體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL試劑一),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時(shí)間3min);8000g ,4離心20min,取上清液置冰上混勻待測(cè)。

3.  血清等液體:直接測(cè)定。

 

MDHAR測(cè)定操作:

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到340 nm,蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑二在25℃水浴鍋中預(yù)熱30 min。

3.依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL試劑三、20μL試劑四、20μL試劑五和120μL試劑二,最后加入20μL上清液,迅速混勻后于340nm比色,記錄30s150s的吸光值30s150s的吸光值A1A2,A=A1-A2。

 

MDHAR活性計(jì)算公式:

a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

(1). 按蛋白濃度計(jì)算

MDHAR活性單位定義:25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol NADH 1個(gè)酶活單位。

 

MDHAR (nmol/min /mg prot) = A÷ε÷d×V反總×109Cpr×V樣)÷T

= 804×A ÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算

MDHAR活性單位定義:25℃中每克樣本每分鐘氧化1nmol NADH 1U。

MDHAR (nmol/min /g 鮮重) = A÷ε÷d×V反總×109W×V÷V樣總÷T

= 804×A ÷W

3)按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

MDHAR活性單位定義:25℃中每104個(gè)細(xì)胞每分鐘氧化1nmol NADH 1個(gè)酶活單位。

MDHAR (nmol/min/104 cell) = A÷ε÷d×V反總×109÷細(xì)胞數(shù)量×V÷V樣總÷T

= 804×A ÷ 細(xì)胞數(shù)量

4)按液體體積計(jì)算

MDHAR活性單位定義:25℃中每毫升液體每分鐘氧化1nmol NADH 1個(gè)酶活單位。

MDHAR (nmol/min /mL) = A÷ε÷d×V反總×109÷V樣)÷T

= 804×A

εNADH摩爾消光系數(shù),6220 L/mol/cm;d:比色皿光徑,1cm;V反總:反應(yīng)體系總體積,0.2mL=2×10-4L;V樣:加入反應(yīng)體系中上清液體積,20μL=0.02mL;V樣總:提取液體積,1 mL;Cpr:上清液蛋白濃度,mg/mL,蛋白質(zhì)濃度需要另外測(cè)定,建議使用本公司蛋白質(zhì)含量BCA試劑盒;W :樣品質(zhì)量;T:反應(yīng)時(shí)間,2min。

 

b.使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下:

(1). 按蛋白濃度計(jì)算

MDHAR活性單位定義:25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol NADH 1個(gè)酶活單位。

MDHAR (nmol/min /mg prot) = A÷ε÷d×V反總×109Cpr×V樣)÷T

= 1608×A ÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算

MDHAR活性單位定義:25℃中每克樣本每分鐘氧化1nmol NADH 1U。

MDHAR (nmol/min /g 鮮重) = A÷ε÷d×V反總×109W×V÷V樣總÷T

= 1608×A ÷W

3)按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

MDHAR活性單位定義:25℃中每104個(gè)細(xì)胞每分鐘氧化1nmol NADH 1個(gè)酶活單位

MDHAR (nmol/min/104 cell) = A÷ε÷d×V反總×109÷細(xì)胞數(shù)量×V÷V樣總÷T

= 1608×A ÷ 細(xì)胞數(shù)量

4)按液體體積計(jì)算

MDHAR活性單位定義:25℃中每毫升液體每分鐘氧化1nmol NADH 1個(gè)酶活單位。

MDHAR (nmol/min /mL) = A÷ε÷d×V反總×109÷V樣)÷T

=1608×A

εNADH摩爾消光系數(shù),6220 L/mol/cmd96孔板光徑,0.5cm;V反總:反應(yīng)體系總體積,0.2mL=2×10-4L;V樣:加入反應(yīng)體系中上清液體積,20μL=0.02mLV樣總:提取液體積,1 mLCpr:上清液蛋白濃度,mg/mL,蛋白質(zhì)濃度需要另外測(cè)定,建議使用本公司蛋白質(zhì)含量BCA試劑盒;W :樣品質(zhì)量;T:反應(yīng)時(shí)間,2min。

 

注意事項(xiàng):

 

臨用前配制的試劑未使用完的4保存,3天內(nèi)使用完。


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