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H2S含量測定試劑盒說明書

發(fā)布時間:2023/10/31      點擊次數(shù):391

H2S含量測定試劑盒說明書

                                         微量法100T/96S

 

 

    意:正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義:

H2S是一種新型氣態(tài)信號分子,存在于腦內的神經遞質,生理濃度的H2S對神經系統(tǒng)海馬的長時程增強功能具有重要的調節(jié)作用,并對自發(fā)性高血壓、出血性休克及肝硬化等疾病的過程發(fā)揮著重要的病理生理效應。

 

測定原理:

H2S與醋酸鋅、N, N-二甲基對苯二胺和硫酸鐵銨等反應生成亞甲基藍,亞甲基藍在665nm處有最大吸收峰,通過測定其吸光值可計算H2S含量。

 

自備實驗用品及儀器:

天平、低溫離心機、酶標儀、96孔板、蒸餾水。

 

試劑組成和配制:

提取液:液體100mL×1瓶,4℃保存。

試劑一:液體25mL×1瓶,4℃保存。

試劑二:液體16mL×1瓶,4℃保存。

試劑三:液體8mL×1瓶,4℃避光保存。

試劑四:液體8mL×1瓶,4℃保存。

試劑五:液體1.5mL×1管,4℃避光保存。

 

樣品處理:

1.        組織:按照組織質量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液)進行冰浴勻漿,然后10000g4℃離心10min,取上清,置冰上待測。

2.        細菌、真菌:按照細胞數(shù)量(104個):提取液體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后10000g,4℃,離心10min,取上清置于冰上待測。

3.        血清(漿):直接測定。

 

操作表:

1、   酶標儀預熱30min,調節(jié)波長至665nm。

2、   操作表


空白管

測定管

樣品(μL


150

H2OμL

150


試劑一(μL

150

150

充分震蕩混勻

試劑二(μL

150

150

10000g4℃,離心10min,去上清,留沉淀

H2OμL

150

150

10000g,4℃,離心10min,去上清,留沉淀

試劑一(μL

75

75

試劑三(μL

75

75

充分震蕩混勻

試劑四(μL

75

75

10000rpm4℃,離心10min,吸取200μL上清96孔板中

試劑五(μL

10

10

混勻,25靜置5min,測定665nm吸光值,記為A測定和A空白,ΔA=A測定-A空白。

 

H2S含量計算公式:

96孔板測定的計算公式如下

標準曲線回歸方程為:y = 0.0022x,R2 = 0.9988

1)組織樣品

a.按照蛋白濃度計算

H2Snmol/mg prot=×V反總÷(V樣×Cpr)=681.8×ΔA÷Cpr

 

b.按照樣本重量計算

H2Snmol/g 鮮重)=×V反總÷(V÷V樣總×W)= 681.8×ΔA÷W

(3) 細胞

H2Snmol/104 cell=×V反總÷V÷V樣總×細胞數(shù)量(萬個)=681.8×ΔA÷細胞數(shù)量(萬個)

 

2)液體樣品H2Snmol/mL=×V反總÷V= 681.8×ΔA

V反總:反應總體積,0.225mLV樣:反應中樣品體積,0.15mLV樣總:加入提取液體積,1mL;W:樣品質量,g;Cpr:蛋白濃度,mg/mL

 

注意事項

Z低檢出限為1nmol/mL。


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