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多胺氧化酶(Polyamine oxidase,PAO)試劑盒說(shuō)明書(shū)

發(fā)布時(shí)間:2023/11/6      點(diǎn)擊次數(shù):447

多胺氧化酶(Polyamine oxidasePAO)試劑盒說(shuō)明書(shū)

                                         微量法100/96


   正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義:                           

多胺氧化酶是催化生物體內(nèi)多胺氧化的關(guān)鍵酶,通過(guò)調(diào)節(jié)體內(nèi)多胺水平和生成物的濃度,參與各種植物體對(duì)逆境脅迫的反應(yīng)和生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。

 

測(cè)定原理:

PAO催化多胺氧化產(chǎn)生過(guò)氧化氫,在過(guò)氧化物酶存在的條件下與底物顯色,在550nm下有特征吸收峰,通過(guò)測(cè)定吸光值增加速率來(lái)反映PAO活性。

 

需自備的儀器和用品:

酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

 

試劑組成和配制:

試劑一:液體120mL×1瓶,4℃保存;

試劑二:液體3mL×1瓶,4℃保存;

試劑三:液體1.5mL×1瓶,4℃保存;

試劑四:液體1.5mL×1瓶,4℃保存。

 

粗酶液提取:

1.        組織:按照組織質(zhì)量(g):試劑一體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進(jìn)行冰浴勻漿,然后10000g,4℃離心20min,取上清,置冰上待測(cè)。

2.        細(xì)菌、真菌:按照細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):試劑一體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL試劑一),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時(shí)間3min);然后10000g,4℃,離心10min,取上清置于冰上待測(cè)。

3.        血清等液體:直接測(cè)定。

 

測(cè)定步驟:

1、   酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至550nm。

2、   樣本測(cè)定

試劑名稱(µL

測(cè)定管

試劑一

140

試劑二

20

試劑三

10

樣本

20

試劑四

10

迅速混勻,于550nm下測(cè)定初始吸光值A130min后吸光值A2。ΔA=A2-A1。

 

PAO活性計(jì)算:

1)按樣本蛋白濃度計(jì)算:

單位定義:每mg組織蛋白在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A550變化0.001為一個(gè)酶活力單位。

PAOU/mg prot)=ΔA×V反總÷V×Cpr÷0.001÷T =333.33×ΔA÷Cpr

2)按樣本鮮重計(jì)算:

單位定義:每g組織在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A550變化0.001為一個(gè)酶活力單位。

PAOU/g 鮮重)=ΔA×V反總÷(W× V÷V樣總)÷0.001÷T =333.33×ΔA÷W

3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:

單位定義:每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A550變化0.001為一個(gè)酶活力單位。

PAOU/104 cell)=ΔA×V反總÷(500×V÷V樣總)÷0.001÷T =0.667×ΔA

(4)按液體體積計(jì)算

單位的定義:每mL液體樣本在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A550變化0.001為一個(gè)酶活力單位。

PAOU/mL=ΔA×V反總÷V÷0.001÷T =333.33×ΔA

V反總:反應(yīng)體系總體積,0.2mLV樣:加入樣本體積,0.02 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,30 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mLW:樣本質(zhì)量,g500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬(wàn)。


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