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多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)試劑盒說(shuō)明書(shū)

發(fā)布時(shí)間:2023/11/6      點(diǎn)擊次數(shù):443

多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)試劑盒說(shuō)明書(shū)

                                      微量法100/48



   正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義:                           

PPOEC1.10.3.1)主要存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,是一種含銅的氧化酶,能使一元酚和二元酚氧化產(chǎn)生醌,從而引起褐化,與果蔬加工、茶葉品質(zhì)和組培等密切相關(guān)。

 

測(cè)定原理:

PPO能夠催化鄰苯二酚產(chǎn)生醌,后者在525nm有特征光吸收。

 

需自備的儀器和用品:

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

 

試劑組成和配制:

提取液:100mL×1瓶,4保存;

試劑一:20mL×1瓶,4保存;

試劑二:5mL×1瓶,4保存;

 

粗酶液提?。?/span>

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備:

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):提取液體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次);8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。

組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱(chēng)取約0.1g組織,加入1mL提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。

2、血清(漿)或果汁樣本的處理:

按照血清(漿)或果汁體積(mL):提取液體積(mL)15~10的比例(建議0.1mL血清(漿)或果汁加入1mL提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。

 

測(cè)定步驟:

1、  分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至525nm,蒸餾水調(diào)零。

2、  樣本測(cè)定(在EP管中依次加入下列試劑)

試劑名稱(chēng)(μL

測(cè)定管

對(duì)照管

樣本

50


煮沸的樣本


50

試劑一

200

200

試劑二

50


蒸餾水


50

37℃(哺乳動(dòng)物)25(其它物種)中準(zhǔn)確水浴10min后,95水浴5min,冷卻至室溫,10000g,25℃離心10min,收集上清,取200μL至微量石英比色皿或96孔板中,525nm處檢測(cè)測(cè)定管和對(duì)照管吸光度,計(jì)算ΔA=A測(cè)定-A對(duì)照。

注意:煮沸樣本的操作:取300μL離心上清于EP管中,進(jìn)行5min 95水浴處理;每個(gè)測(cè)定管需要設(shè)一個(gè)對(duì)照管,可以在不同對(duì)照管中加入不同樣品的粗酶液,然后集中進(jìn)行5min 95水浴處理。

 

PPO活性計(jì)算:

a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、血清(漿)或果汁PPO活性

單位的定義:每分鐘每mL血清(漿)或果汁在每mL反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化

0.01為一個(gè)酶活力單位。

PPOU/mL=ΔA×V反總÷(V× V÷V樣總)÷0.01÷T =60×ΔA÷V

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞PPO活性

1)按樣本蛋白濃度計(jì)算:

單位定義:每分鐘每mg組織蛋白在每mL反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化0.01為一個(gè)

酶活力單位。

PPOU/mg prot=ΔA×V反總÷V×Cpr÷0.01÷T =60×ΔA÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。

2)按樣本鮮重計(jì)算:

單位定義:每分鐘每g組織在每mL反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化0.01為一個(gè)

酶活力單位。

PPOU/g 鮮重=ΔA×V反總÷(W× V÷V樣總)÷0.01÷T =60×ΔA÷W

3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:

單位定義:每分鐘每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在每mL反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化0.01為一個(gè)酶活力單位。

PPOU/104 cell=ΔA×V反總÷(500×V÷V樣總)÷0.01÷T =0.12×ΔA

V反總:反應(yīng)體系總體積,0.3mL;V液:加入血清(漿)或果汁體積,0.1mL; V樣:加入樣本體積,0.05mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,10 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mLW:樣本質(zhì)量,g500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500萬(wàn)。

 

b.96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、血清(漿)或果汁PPO活性

單位的定義:每分鐘每mL血清(漿)或果汁在每mL反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化

0.005為一個(gè)酶活力單位。

PPOU/mL=ΔA×V反總÷(V× V÷V樣總)÷0.005÷T =120×ΔA÷V

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞PPO活性

1)按樣本蛋白濃度計(jì)算:

單位定義:每分鐘每mg組織蛋白在每mL反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化0.005為一個(gè)

酶活力單位。

PPOU/mg prot=ΔA×V反總÷V×Cpr÷0.005÷T =120×ΔA÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。

2)按樣本鮮重計(jì)算:

 

單位定義:每分鐘每g組織在每mL反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化0.005為一個(gè)

酶活力單位。

PPOU/g 鮮重=ΔA×V反總÷(W× V÷V樣總)÷0.005÷T =120×ΔA÷W

3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:

單位定義:每分鐘每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在每mL反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化0.005為一個(gè)酶活力單位。

PPOU/104 cell=ΔA×V反總÷(500×V÷V樣總)÷0.005÷T =0.24×ΔA

V反總:反應(yīng)體系總體積,0.3mL;V液:加入血清(漿)或果汁體積,0.1mL; V樣:加入樣本體積,0.05mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,10 minCpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500萬(wàn)。


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