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二胺氧化酶(Diamine Oxidase,DAO)試劑盒說明書

發(fā)布時(shí)間:2023/11/7      點(diǎn)擊次數(shù):435

二胺氧化酶(Diamine Oxidase,DAO)試劑盒說明書

                                                     微量法100T/48S

 

   正式測定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義:

DAO(EC1.4.3.6)廣泛存在于動(dòng)物(腸粘膜、肺、肝臟、腎臟等)、植物和微生物中。催化多胺氧化為醛,其活性與核酸和蛋白合成密切相關(guān),能夠反映腸道機(jī)械屏障的完整性和受損傷程度。

 

測定原理:

DAO催化尸胺產(chǎn)生醛和過氧化氫,外源添加過量的辣根過氧化物酶,催化過氧化氫氧化鄰聯(lián)茴香胺生成氧化型鄰聯(lián)茴香胺,在460nm處有特征吸收峰,通過測定該波長吸光度增加速率,計(jì)算DAO活性。

 

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器:

天平、低溫離心機(jī)、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、蒸餾水。

 

試劑組成和配制:

提取液:液體120mL×1瓶,4℃保存。

試劑一:液體0.3mL×1支,4℃保存。

試劑二:液體2.5mL×1瓶,4℃保存。

試劑三:液體1.2mL×1管,4℃保存。

 

粗酶液提?。?/span>

1.        組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液)進(jìn)行冰浴勻漿,然后10000g,4℃離心20min,取上清,置冰上待測。

2.        細(xì)菌、真菌:按照細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):提取液體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時(shí)間3min);然后10000g,4℃,離心10min,取上清置于冰上待測。

3.        血清等液體:直接測定。

 

測定操作表:

1、分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min,調(diào)節(jié)波長至460nm,蒸餾水調(diào)零。

2、操作表


對照管

測定管

粗酶液(μL

50

50

提取液(μL

128

108

試劑一(μL

2

2

試劑二(μL

20

20

試劑三(μL


20

混勻,37℃水浴30min,微量石英比色皿/96孔板,蒸餾水調(diào)零,測定460nm吸光值。ΔA=A測定-A對照。

 

 

酶活性計(jì)算公式:

a. 用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下

1)按樣本蛋白濃度計(jì)算:

酶活性定義:pH7.2,溫度為37℃條件下,毫克組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol H2O2所需的酶量為一個(gè)酶活力單位(U)。

DAO活性(nmol/min/mg prot= ×V反總÷V×Cpr÷T= 18×A460÷Cpr

2)按樣本質(zhì)量計(jì)算:

酶活性定義:pH7.2,溫度為37℃條件下,組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol H2O2所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位。

DAO活性(nmol/min/g 鮮重)= ×V反總÷V÷V樣總×W÷T= 18×A460÷W

3)按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算:

酶活性定義:pH7.2,溫度為37℃條件下,104個(gè)細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol H2O2所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位。

DAO活性(nmol/min/104cell= ×V反總÷V÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量)÷T= 18×A460÷細(xì)胞數(shù)量

 

(4) 按液體體積計(jì)算

酶活性定義:pH7.2,溫度為37℃條件下,毫升血清每分鐘催化產(chǎn)生1nmol H2O2所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位。

DAO活性(nmol/min/mL= ×V反總÷V÷T= 18×A460

ε:氧化型鄰聯(lián)茴香胺毫摩爾消光系數(shù):7.5 L/mmol/cmd:比色皿光徑,1cm;V反總:反應(yīng)總體積,0.2mL;V樣:反應(yīng)中樣本體積,0.05mLV樣總:加入提取液體積,1mL;Cpr:樣本蛋白濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,gT:反應(yīng)時(shí)間,30min

b. 96孔板測定的計(jì)算公式如下

1)按樣本蛋白濃度計(jì)算:

酶活性定義:pH7.2,溫度為37℃條件下,毫克組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol H2O2所需的酶量為一個(gè)酶活力單位(U)。

DAO活性(nmol/min/mg prot= ×V反總÷V×Cpr÷T= 36×A460÷Cpr

2)按樣本質(zhì)量計(jì)算:

酶活性定義:pH7.2,溫度為37℃條件下,組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol H2O2所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位。

DAO活性(nmol/min/g 鮮重)= ×V反總÷V÷V樣總×W÷T= 36×A460÷W

 

3)按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算:

酶活性定義:pH7.2,溫度為37℃條件下,104個(gè)細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol H2O2所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位。

DAO活性(nmol/min/104cell= ×V反總÷V÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量)÷T= 36×A460÷細(xì)胞數(shù)量

(4) 按液體體積計(jì)算

酶活性定義:pH7.2,溫度為37℃條件下,毫升血清每分鐘催化產(chǎn)生1nmol H2O2所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位。

DAO活性(nmol/min/mL= ×V反總÷V÷T= 36×A460

ε:氧化型鄰聯(lián)茴香胺毫摩爾消光系數(shù):7.5 L /mmol/cmd96孔板光徑,0.5cm;V反總:反應(yīng)總體積,0.2mL;V樣:反應(yīng)中樣本體積,0.05mL;V樣總:加入提取液體積,1mLCpr:樣本蛋白濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,gT:反應(yīng)時(shí)間,30min

 

注意事項(xiàng):

1、如果OD值小于0.01,適當(dāng)加大提取用樣本量;OD值大于0.8,粗酶液可適當(dāng)稀釋,或者減少提取用樣本量。

2、樣品蛋白質(zhì)含量需要另外測定。


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