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非蛋白巰基測(cè)定試劑盒說明書

發(fā)布時(shí)間:2023/11/7      點(diǎn)擊次數(shù):436

非蛋白巰基測(cè)定試劑盒說明書

                                                  微量法100T/48S

 

 

   :正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義:

生物體內(nèi)巰基主要包括非蛋白質(zhì)巰基和蛋白質(zhì)巰基。巰基化合物在體內(nèi)具有重要的解毒功能,對(duì)生物體的自我調(diào)節(jié)具有非常重要的生理意義。

 

測(cè)定原理:

巰基基團(tuán)與5,5’-二硫代--硝基苯甲酸DTNB反應(yīng),生成黃色化合物,在412nm處有最大吸收峰。

 

自備實(shí)驗(yàn)用品:

天平、研缽、恒溫水浴鍋、酶標(biāo)儀、96孔板、乙醇和蒸餾水。

 

試劑組成和配制:

提取液:液體100 mL×1瓶,4保存。

試劑一:液體18 mL×1瓶,4保存。

試劑二:液體1mL×1管,4避光保存。

 

樣品的制備:

1.        按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液)進(jìn)行冰浴勻漿,然后8000g4℃離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。

2.        血清,培養(yǎng)液:取0.1mL樣本,加入0.4mL提取液,混勻,室溫靜置10min, 然后8000g4℃離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。

 

操作步驟:

1、   酶標(biāo)儀預(yù)熱30min,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至412nm。

2、   操作表

96孔板中加入如下試劑


對(duì)照管

測(cè)定管

樣品(μL

40

40

試劑一(μL

150

150

試劑二(μL


10

乙醇μL

10


混勻,25℃靜置10min,測(cè)定412nm吸光值。ΔA=A測(cè)定-A對(duì)照。每個(gè)測(cè)定管設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

 

計(jì)算公式:

非蛋白巰基標(biāo)準(zhǔn)曲線:y = 1.8111x - 0.0037,R2 = 1x為標(biāo)品濃度,單位μmol/mLy為吸光度ΔA。

1. 組織:

1)按樣本重量計(jì)算

 

非蛋白巰基含量(μmol/g 鮮重)=(ΔA+0.0037)÷1.8111×V樣總÷W

=0.552×(ΔA+0.0037)÷W

 

2)按樣本蛋白濃度計(jì)算

非蛋白巰基含量(μmol/mg prot=(ΔA+0.0037)÷1.8111×V樣總÷Cpr

=0.552×(ΔA+0.0037)÷Cpr

                                        

2. 血清、培養(yǎng)液:

非蛋白巰基含量(μmol/L=(ΔA+0.0037)÷1.8111×5×103

=2761×(ΔA+0.0037

 

V樣總:加入提取液體積,1mL;W:樣品質(zhì)量,g Cpr:樣本蛋白濃度,mg/mL;5血清,培養(yǎng)液等液體樣本稀釋倍數(shù);103 1mmol/ L=103μmol/ L

 

注意事項(xiàng)

Z低檢出限為10μmol/L。


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