非蛋白巰基測(cè)定試劑盒說明書

                                                  微量法100T/48S

注   意 ：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

生物體內(nèi)巰基主要包括非蛋白質(zhì)巰基和蛋白質(zhì)巰基。巰基化合物在體內(nèi)具有重要的解毒功能，對(duì)生物體的自我調(diào)節(jié)具有非常重要的生理意義。

測(cè)定原理：

巰基基團(tuán)與5,5’-二硫代-雙-硝基苯甲酸（DTNB）反應(yīng)，生成黃色化合物，在412nm處有最大吸收峰。

自備實(shí)驗(yàn)用品：

天平、研缽、恒溫水浴鍋、酶標(biāo)儀、96孔板、乙醇和蒸餾水。

試劑組成和配制：

提取液：液體100 mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體18 mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體1mL×1管，4℃避光保存。

樣品的制備：

1.        按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后8000g，4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2.        血清，培養(yǎng)液：取0.1mL樣本，加入0.4mL提取液，混勻，室溫靜置10min, 然后8000g，4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

操作步驟：

1、   酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至412nm。

2、   操作表

在96孔板中加入如下試劑

計(jì)算公式：

非蛋白巰基標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 1.8111x - 0.0037，R² = 1，x為標(biāo)品濃度，單位μmol/mL，y為吸光度ΔA。

1. 組織：

（1）按樣本重量計(jì)算

非蛋白巰基含量（μmol/g 鮮重）=（ΔA+0.0037）÷1.8111×V樣總÷W

=0.552×（ΔA+0.0037）÷W

（2）按樣本蛋白濃度計(jì)算

非蛋白巰基含量（μmol/mg prot）=（ΔA+0.0037）÷1.8111×V樣總÷Cpr

=0.552×（ΔA+0.0037）÷Cpr

2. 血清、培養(yǎng)液：

非蛋白巰基含量（μmol/L）=（ΔA+0.0037）÷1.8111×5×10³

=2761×（ΔA+0.0037）

V樣總：加入提取液體積，1mL；W：樣品質(zhì)量，g ；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；5：血清，培養(yǎng)液等液體樣本稀釋倍數(shù)；10³ ：1mmol/ L=10³μmol/ L

注意事項(xiàng)：

Z低檢出限為10μmol/L。