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過(guò)氧化氫酶(Catalase,CAT)試劑盒(鉬酸銨比色法)說(shuō)明書(shū)

發(fā)布時(shí)間:2023/11/7      點(diǎn)擊次數(shù):549

過(guò)氧化氫酶(Catalase,CAT)試劑盒(鉬酸銨比色法)說(shuō)明書(shū)

微量法100/96


測(cè)定意義:                           

CAT(EC 1.11.1.6)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,是最主要的H2O2清除酶,在活性氧清除系統(tǒng)中具有重要作用。

 

測(cè)定原理:

過(guò)氧化氫能氧化MoO42-MoO52-,MoO52-接受氫氧根的電子成鍵,分子間立即脫水縮合,得到穩(wěn)定的黃色復(fù)合物(H2MoO4·XH2O)n405nm處有強(qiáng)烈吸收峰,其吸光值和過(guò)氧化氫濃度成線性關(guān)系。測(cè)定出體系剩余過(guò)氧化氫在405nm的吸光值即可反映CAT的催化活性。

 

需自備的儀器和用品:

酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、96孔板、研缽、冰和蒸餾水

 

試劑組成和配制:

提取液:液體100 mL×1瓶,4℃保存;

試劑一:液體10 mL×1瓶,4℃避光保存;

試劑二:液體25 mL×1瓶,常溫保存;

試劑三:液體60 mL×1瓶,4℃保存;

 

粗酶液提?。?/span>

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備:

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):提取液體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次);8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。

組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱(chēng)取約0.1g組織,加入1mL提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。

2、血清(漿)樣品:直接檢測(cè)。

 

測(cè)定步驟:

1、   酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至405 nm。

2、在EP管中加入下列試劑

試劑名稱(chēng)(μL

測(cè)定管

空白

樣本

10


試劑一

60


混勻,25℃準(zhǔn)確反應(yīng)2 min

試劑二

200


試劑三

530

530

試劑二


200

提取液


10

試劑一


60

混勻,200μL96孔板立即測(cè)定A空白A測(cè)定,ΔA=A空白-A測(cè)定。空白管只需做一管。

 

CAT活性計(jì)算:

1、標(biāo)準(zhǔn)曲線:y = 0.09x + 0.0013      R2 = 1      x:體系中過(guò)氧化氫濃度變化值(μmol/mL

                                          y:吸光值差值ΔA

2、血清(漿)CAT活力的計(jì)算:

單位的定義:每毫升血清(漿)每分鐘催化1μmol H2O2降解定義為一個(gè)酶活力單位。

CAT(μmol /min/mL)= =(ΔA-0.0013)÷0.09×V反總÷V÷T

                    =444.44×(ΔA-0.0013)

3、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中CAT活力計(jì)算:

1)按樣本蛋白濃度計(jì)算:

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化1μmol H2O2降解定義為一個(gè)酶活力單位。

CAT(μmol/min/mg prot)=(ΔA-0.0013)÷0.09×V反總÷(V×Cpr) ÷T

                    =444.44×(ΔA-0.0013)÷Cpr

2)按樣本鮮重計(jì)算:

單位的定義:每g組織每分鐘催化1μmol H2O2降解定義為一個(gè)酶活力單位。

CAT(μmol/min/g 鮮重)=(ΔA-0.0013)÷0.09×V÷W× V÷V樣總)÷T

                    =444.44×(ΔA-0.0013)÷W

V反總:反應(yīng)體系總體積,0.8 mL;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,2 minW:樣本質(zhì)量,g;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL。

 

注意事項(xiàng):

1、   預(yù)實(shí)驗(yàn)若發(fā)現(xiàn)酶活性過(guò)高(A測(cè)定<0.1),可用提取液適當(dāng)稀釋樣品后測(cè)定,并在計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。

2、   A空白<A測(cè)定,一方面可能是酶活性過(guò)低,可將反應(yīng)時(shí)間2延長(zhǎng)到5min,另一方面可能樣本中雜質(zhì)干擾嚴(yán)重,可將樣本稀釋5倍左右后測(cè)定,并在計(jì)算公式中代入實(shí)際反應(yīng)時(shí)間和乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。


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