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過氧化氫含量(H2O2)試劑盒說明書

發(fā)布時(shí)間:2023/11/7      點(diǎn)擊次數(shù):662

過氧化氫含量(H2O2)試劑盒說明書  

                                         微量法100/96

 

 

    意:正式測定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義:

H2O2是生物體內(nèi)最常見的活性氧分子,主要由SODXOD等催化產(chǎn)生,由CATPOD等催化降解。H2O2不僅是重要的活性氧之一,也是活性氧相互轉(zhuǎn)化的樞紐。一方面,H2O2可以直接或間接地氧化細(xì)胞內(nèi)核酸,蛋白質(zhì)等生物大分子,并使細(xì)胞膜遭受損害,從而加速細(xì)胞的衰老和解體;另一方面H2O2也是許多氧化應(yīng)急反應(yīng)中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,。

 

測定原理:

H2O2與硫酸鈦生成黃色的過氧化鈦復(fù)合物,在415nm有特征吸收。

 

需自備的儀器和用品:

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、丙酮100mL、濃鹽酸5mL、研缽和冰。

 

試劑的組成和配制:

試劑一:丙酮100mL×1瓶,4保存;(自備)

試劑二:粉劑×1瓶,4保存;臨用前加入3mL濃鹽酸充分溶解備用。用不完的試劑4保存(溶解時(shí)間較長,約30min,可40-60℃加熱,務(wù)必提前準(zhǔn)備)

試劑三:液體10mL×1瓶,4保存;

試劑四:液體30mL×1瓶,4保存;

 

H2O2提取:

1、細(xì)菌或細(xì)胞樣品的制備:收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):試劑一體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL試劑一)超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次);用試劑一定容至1mL;8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測。

2. 組織樣品的制備:按照組織質(zhì)量(g):試劑一體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進(jìn)行冰浴勻漿;轉(zhuǎn)移至EP管中,用試劑一定容至1mL,8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測。

3、血清(漿)樣品:直接檢測。

 

測定步驟

1、  分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至415nm,蒸餾水調(diào)零。

2、   將試劑二、三和四37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)水浴10min以上。

3、  EP管中按順序加入下列試劑

試劑名稱μL

測定

對照

樣本

250


試劑一


250

試劑二

25

25

試劑三

50

50

4000g,25離心10min,棄上清,留沉淀

試劑四

250

250

加入試劑四溶解沉淀后,室溫靜置5min,取200μL轉(zhuǎn)移至微量石英比色皿或96孔板中測定415nm處吸光值A。對照管只要做一次即可。計(jì)算ΔAA測定-A對照。

 

注意事項(xiàng):

1、由于試劑一易揮發(fā),試劑一必須先預(yù)冷再加,研磨時(shí)必須在冰上研磨

2、本試劑盒中試劑的揮發(fā)性較高,請帶一次性手套和口罩。

 

H2O2含量計(jì)算:

a. 用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸曲線,y = 0.7488x + 0.0006 (x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度,μmol/mL;yΔA)

2、血清(漿)中H2O2含量的計(jì)算:

H2O2含量(μmol/mL(ΔA-0.0006) ÷0.7488=1.34×(ΔA-0.0006)

3、細(xì)菌、細(xì)胞或動物組織中H2O2含量計(jì)算

1)按照蛋白濃度計(jì)算

H2O2含量(μmol/mg prot)=[ (ΔA-0.0006) ÷0.7488×V1]÷(V1×Cpr)= 1.34×(ΔA-0.0006)÷Cpr

需要另外測定,建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。

2)按照樣本質(zhì)量計(jì)算

H2O2含量(μmol/g鮮重)=[ (ΔA-0.0006) ÷0.7488×V1]÷(W ×V1÷V2)= 1.34×(ΔA-0.0006)÷W

 (3 ) 按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:

H2O2含量(μmol/104)=[ (ΔA-0.0006) ÷0.7488×V1]÷(500×V1÷V2)=0.0027×(ΔA-0.0006)

V1:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.25mL;V2:加入提取液體積,1mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500萬。

 

b. 96孔板測定的計(jì)算公式如下

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸曲線,y = 0.3744x + 0.0006  (x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度,μmol/mLyΔA)。

2、血清(漿)中H2O2含量的計(jì)算:

H2O2含量(μmol/mL(ΔA-0.0006)÷0.3744=2.67×(ΔA-0.0006)

3、細(xì)菌、細(xì)胞或組織中H2O2含量計(jì)算

1)按照蛋白濃度計(jì)算

H2O2含量(μmol/mg prot)=[(ΔA-0.0006) ÷0.3744×V1]÷(V1×Cpr)=2.67×(ΔA-0.0006) ÷Cpr

需要另外測定,建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。

2)按照樣本質(zhì)量計(jì)算

H2O2含量(μmol/g鮮重)=[(ΔA-0.0006) ÷0.3744×V1]÷(W ×V1÷V2)= 2.67×(ΔA-0.0006) ÷W

 (3 ) 按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:

H2O2含量(μmol/104)=[(ΔA-0.0006) ÷0.3744×V1]÷(500×V1÷V2)= 0.0054×(ΔA-0.0006)

V1:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.25mLV2:加入提取液體積,1mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mLW:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500萬。

 

注意:標(biāo)曲線性范圍為0.1μmol/mL-2μmol/mL,吸光度ΔA線性范圍為0.03-1,若ΔA超過1則需要稀釋,計(jì)算公式乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。


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